HiSpeed Plasmid Mega and Giga EF Kits

• 프렙 소요 시간 약 50분
• 원심분리 없이 용해물 클리어링 및 아이소프로판올 침전 처리
• 침전 중 DNA 펠릿 손실 위험 없음
• 최대 10mg의 high-copy 플라스미드 DNA 수율
• 최적의 용해와 최대 DNA 수율을 위한 LyseBlue
• 내독소 제거 포함(<0.04EU/μg DNA)

HiSpeed Plasmid Mega 및 Giga EF Kits는 진공을 이용한 대용량 음이온 교환 방식의 플라스미드 DNA 프렙을 제공하며, 최종 플라스미드 DNA를 용출할 때 단 한 번의 원심분리 단계만 필요합니다. 정제된 DNA는 2회 CsCl 구배 원심분리로 얻은 DNA와 동등하며, 트랜스펙션 등급의 응용 분야에 적합합니다. 프로토콜에는 QIAvac HiSpeed LS 진공 매니폴드가 필요합니다.

HiSpeed EF Mega Giga Kits는 QIAvac HiSpeed LS와 함께 사용해야 합니다.

HiSpeed Plasmid Mega 및 Giga EF Kits에는 진공 매니폴드를 사용하여 플라스미드를 신속하게 대량으로 프렙할 수 있도록 QIAfilter 카트리지, HiSpeed 팁, QIAconcentrator 모듈이 포함되어 있습니다. 진공을 사용하는 QIAfilter 모듈은 기존 음이온 교환 절차에 필요했던 원심분리 과정을 대체하여 더 쉽고 빠른 정제를 가능하게 합니다. QIAconcentrator를 사용하면 에탄올 침전 후 원심분리를 통해 고농축 DNA를 얻을 수 있습니다. 500mL 배양액에서 최대 2.5mg(Mega), 2.5L 배양액에서 최대 10mg(Giga)의 High-copy 플라스미드 DNA를 정제할 수 있습니다(배양액의 부피는 플라스미드 복제 수, 삽입 유전자 크기, 숙주 균주, 배지 종류에 따라 달라짐). 또한 HiSpeed 팁의 설계로 유속이 매우 빨라져 플라스미드 정제를 위한 DNA 결합, 세척, 용출 단계를 더 빠르게 진행할 수 있습니다. HiSpeed로 정제된 플라스미드 DNA에는 내독소가 없습니다(0.04EU/µg DNA 미만).

HiSpeed 팁에 사용된 독자적인 음이온 교환 수지는 핵산 정제를 위해 특별히 개발되었습니다. 탁월한 분리 특성 덕분에 이 방법으로 얻은 DNA의 순도는 두 번 연속 CsCl 구배 원심분리로 얻은 것과 같거나 이보다 더 우수합니다. HiSpeed Plasmid Mega 및 Giga EF Kits는 용해 단계에서 방출되는 박테리아 내독소를 제거하여 이들이 1차 세포나 민감한 배양 세포로의 DNA 트랜스펙션에 영향을 미치는 것을 방지합니다. HiSpeed Plasmid Mega/Giga EF Kits로 얻은 내독소 무함유 DNA는 트랜스펙션에서 재현 가능하고 안정적인 결과를 얻기에 매우 적합합니다. QIAGEN의 초고순도 내독소 무함유 DNA는 유전자 치료 연구를 비롯한 다양한 민감한 응용 분야에도 사용할 수 있습니다.

QIAfilter 카트리지(그림 ‘ QIAfilter Mega-Giga 카트리지’ 참고)는 박테리아 세포를 알칼리 용해한 후의 원심분리 단계를 대체할 수 있도록 설계된 특별한 필터 장치입니다. QIAfilter 카트리지를 사용하면 원심분리보다 훨씬 빠른 시간 안에 SDS 침전물을 완전히 제거하고 박테리아 용해물을 클리어링할 수 있습니다. 미리 채워진 HiSpeed 팁은 중력의 힘으로 작동하며 건조해지지 않아 플라스미드 준비에 필요한 수작업 시간이 최소화됩니다.

독자적인 QIAconcentrator(그림 ‘ HighSpeed Plasmid Giga EF 절차’ 참고)는 정제 후 아이소프로판올로 침전된 DNA를 회수할 때 전통적으로 사용되던 원심분리 단계를 대체합니다. QIAconcentrator 모듈은 침전된 DNA는 포집하고 아이소프로판올-완충액 혼합물은 통과시킵니다. 이후 DNA는 QIAprecipitator에서 TE 완충액이나 물로 간단히 용출되어 채집(collection) 튜브에 모을 수 있습니다. 이 특별한 모듈은 원심분리 후 상층액을 버리는 과정에서 펠릿이 유실되는 문제도 방지할 수 있습니다.

내독소는 지질다당질 또는 LPS(lipopolysaccharides)라고도 하며, E. coli와 같은 그람음성균의 세포막 성분입니다(그림 ‘ 박테리아 세포벽’ 참고). 플라스미드 정제 과정의 용해 단계에서 내독소가 방출되며, 이는 내독소에 민감한 세포주에서 트랜스펙션 효율을 크게 감소시킵니다. 또한 내독소는 ‘유리(free)’ 트랜스펙션 시약과 DNA의 결합을 방해하여 트랜스펙션 실험에서 플라스미드 DNA가 세포로 잘 들어가지 못하게 만들 수 있습니다.

내독소는 대식세포나 B세포 등 면역세포의 비특이적 면역 반응을 유발하여, 트랜스펙션 실험 결과를 잘못 해석하게 만들 수 있습니다. 이러한 반응에는 IL-1과 프로스타글란딘과 같은 단백질 및 지질의 유도 합성이 포함됩니다. 전반적으로 내독소는 트랜스펙션 실험 환경에서 통제할 수 없는 변수로 작용하여 실험 결과와 결과의 재현성에 영향을 미치며, 결과 비교와 해석을 어렵게 만듭니다. 유전자 치료 연구에서는 내독소가 내독소 쇼크 증후군을 일으키거나 보체 활성화를 유발하여 실험에 악영향을 줄 수 있습니다.

중화된 박테리아 용해물은 QIAfilter 카트리지에서 인큐베이션된 후, 진공을 이용하여 몇 초 만에 클리어링됩니다. 이 단계에서 내독소 제거 완충액을 여과된 용해물에 첨가합니다. 인큐베이션은 필요하지 않습니다. 여과물은 플라스미드 DNA를 정제하기 위해 HiSpeed 팁에 넣어 처리됩니다(그림 ‘ HighSpeed Plasmid Giga EF 절차’ 참고). 용출된 DNA는 아이소프로판올과 혼합된 뒤 QIAconcentrator에 진공 방식으로 적용하여 세척합니다. 농축되고 탈염된 DNA는 이후 TE 완충액이나 물을 사용하여 QIAconcentrator에서 바로 새로운 채집(collection) 튜브에 용출됩니다.

HiSpeed Plasmid Mega 및 Giga EF Kits로 정제한 DNA는 클로닝과 염기서열 분석부터 매우 민감한 세포 및 1차 세포의 트랜스펙션, 플라스미드를 이용한 유전자 침묵화에 이르기까지 모든 응용 분야에서 우수한 결과를 제공합니다.