HotStarTaq Master Mix Kit

どのようなPCRアプリケーションでも特異性の高い増幅を実現

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HotStarTaq Master Mix Kit (250 U)

Cat. No. / ID:  203443

3 x 0.85 ml HotStarTaq Master Mix (contains 250 units HotStarTaq DNA Polymerase, PCR Buffer with 3 mM MgCl2, and 400 µM of each dNTP)and 2 x 1.7 ml RNase-Free Water
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Units
250 U
1000 U
2500 U
HotStarTaq Master Mix Kitは分子生物学的アプリケーション用であり、疾病の診断、予防、あるいは治療に使用することはできません。
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Features

  • 至適化なしに高いPCR特異性を実現
  • 反応セットアップが室温で可能
  • 即使用可能なマスターミックスフォーマットでピペッティング操作が減少

Product Details

HotStarTaq Master Mixには、HotStarTaq DNA Polymerase、至適化が最小限で済む画期的なQIAGEN PCR Buffer、およびdNTPが含まれています。マスターミックスには全ての成分が含まれているので、ピペッティングステップとコンタミのリスクが減少し、スループット数と再現性が増加します。

Performance

HotStarTaq Master Mix Kitは全てのロットで、低コピー数のターゲットを増幅する実験によりPCR特異性の厳密さや再現性をチェックするなど、広範囲の品質管理テストを受けています。HotStarTaq Master Mix Kitは他社のキットに比べて高性能で、特異性と感度の高いホットスタートPCRを実現します(図" Higher specificity with different primer–template systems異なるプライマー/テンプレートシステムにおける高特異性"、" 卓越した性能 " および表)。キットに付属の画期的なPCRバッファーは、様々なPCR条件において特異性を実現し、至適化は最小限に抑えられます(図 " 幅広い至適アニーリング温度" および" 異なったマグネシウム濃度への適応")。

高い特異性と簡便な操作を実現するHotStarTaq Master Mix Kitは、複雑なゲノムテンプレートあるいはcDNAテンプレート(図“ RT-PCR性能へのホットスタートの影響”)、複数のプライマーペア(図“ Multiplex PCRにおける特異的な増幅”)、増幅困難なサンプルあるいは低コピーのターゲット(図“ 高感度のシングルセルPCR”)などとの使用に適しています。これはまた、遺伝子スクリーニングのような多数サンプルを増幅するプロジェクトに最適です。

ホットスタート法の比較 
HotStarTaq DNA Polymerase ホットスタート酵素AII 抗体利用 マニュアル ワックスバリア
特異的な増幅 ++ + + +/– +/–
PCR至適化の不要性 ++ +/– +/–
取り扱いの簡便さ ++ ++ +
HotStarTaq DNA Polymerase 詳細データ

濃度:5 units/µl
組み換え酵素:Yes
基質アナログ:dNTP、ddNTP、dUTP、biotin-11-dUTP、DIG-11-dUTP、 fluorescent-dNTP/ddNTP
エクステンション速度:72℃ で2~4 kb/min 
半減期:97℃で10分、94℃で60分 
増幅効率:≥105
5'–>3' エキソヌクレアーゼ活性:Yes
余分なA付加:Yes
3'–>5' エキソヌクレアーゼ活性:No
ヌクレアーゼの混入:No
RNasesの混入:No
プロテアーゼの混入:No
自己プライマー活性:No 

See figures

Principle

HotStarTaq Master Mixは即使用可能なマスターミックスで、HotStarTaq DNA Polymerase、QIAGEN PCR Buffer、dNTPsが入っています。Taq DNA Polymeraseを修飾したHotStarTaq DNA PolymeraseはホットスタートPCR において高い特異性を実現します。

HotStarTaq DNA Polymerase

HotStarTaq DNA Polymeraseは、常温では不活性状態でポリメラーゼ活性はありません。この特性により、PCR セットアップや最初のPCR サイクル中の低温での非特異的なプライマーのアニーリングやプライマーダイマーの形成を回避できます(図" ホットスタートPCRで最高のパフォーマンスを実現"および"異なるプライマー/テンプレートシステムにおける高特異性")。HotStarTaq DNA Polymeraseは、95℃、15 分間のインキュベーションステップで活性化され、このステップは既存のサーマルサイクリングのプログラムに容易に導入できます。

QIAGEN PCR Buffer

QIAGEN PCR Buffer は、各PCRサイクルでアニーリングステップ中にプライマー特異的な結合の割合を非特異的な結合に対して高めることにより、各PCRサイクルの特異的な増幅を維持します(図“ プライマーのアニーリングの特異性増大”)。このバッファーはユニークな配合比のKClと (NH4)2SO4を含み、従来のPCRバッファーに比べ、幅広いアニーリング温度やMg2+濃度の範囲で厳密で特異的なプライマーアニーリングを実現します。従って、異なるアニーリング温度あるいはMg2+濃度を用いて行なうPCRの至適化は最小限ですみ、または不要なこともあります(図 " 幅広い至適アニーリング温度"および" 異なったマグネシウム濃度への適応")。

See figures

Procedure

HotStarTaq Master Mix Kitは簡便なマスターミックスフォーマットですので、操作は容易です。HotStarTaq DNA Polymeraseは、95℃、15 分間のインキュベーションステップで活性化され、このステップは既存のサーマルサイクリングのプログラムに容易に導入できます。マスターミックスを用いて、反応セットアップを室温で迅速かつ容易に行なえます。 25 µlのHotStarTaq Master Mixを各PCRチューブにピペットでいれ、RNaseフリー水(キットに付属)で希釈したプライマーとテンプレートDNAを25 µl添加します(図" HotStarTaq操作手順")。ピペッティングステップは最小限に抑えられ、エラーとコンタミのリスクが減少し、スループット数と再現性が増加します。キットに付属の至適化済みのプロトコールにより、PCRセットアップを迅速かつ容易に行なえます。
See figures

Applications

HotStarTaq Master Mix Kitは、増幅などの高度なアプリケーションを含む様々なアプリケーションに最適です: 

  • 複雑なゲノムテンプレート
  • 複雑なcDNAテンプレート(例;RT-PCR)
  • 低コピーのターゲット(例;シングルセルPCR)
  • マルチプレックスPCR

Supporting data and figures

Specifications

FeaturesSpecifications
ApplicationsPCR, RT-PCR, Complex genomic templates, very low-copy targets
Real-time or endpointEndpoint
MastermixYes
Enzyme activity5'-> 3' exonuclease activity
Sample/target typeGenomic DNA and cDNA
Single or multiplexSingle
Reaction typePCR amplification
With/without hotstartWith hotstart

Resources

クイックスタートプロトコール (1)
User-Developed Protocols (1)
As starting material, 5 g soil was mixed with different amounts of Bacillus subtilis cells. Sensitivity was 5 x 103 cells/5g soil.
キットハンドブック (1)
HotStarTaq DNA Polymerase; HotStarTaq Master Mix Kit - For highly specific hot-start PCR without optimization  
パンフレット (2)
Addressing critical factors and new solutions
MSDS (1)
Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.
テクニカルインフォメーション (1)
Certificates of Analysis (1)
Brochures & Guides (2)
Addressing critical factors and new solutions
Kit Handbooks (1)
HotStarTaq DNA Polymerase; HotStarTaq Master Mix Kit - For highly specific hot-start PCR without optimization  
Quick-Start Protocols (1)

Publications

Rapid detection of point mutations conferring resistance to fluoroquinolone in gyrA of Helicobacter pylori by allele-specific PCR.
Nishizawa T; Suzuki H; Umezawa A; Muraoka H; Iwasaki E; Masaoka T; Kobayashi I; Hibi T;
J Clin Microbiol; 2006; 45 (2):303-5 2006 Nov 22 PMID:17122023
Quantitative detection of DNA methylation states in minute amounts of DNA from body fluids.
Paliwal A; Vaissière T; Herceg Z;
Methods; 2010; 52 (3):242-7 2010 Apr 1 PMID:20362673
Quantitative PCR-based approach for rapid phage display analysis: a foundation for high throughput vascular proteomic profiling.
Ballard VL; Holm JM; Edelberg JM;
Physiol Genomics; 2006; 26 (3):202-8 2006 May 16 PMID:16705020
Megalin-dependent internalization of cadmium-metallothionein and cytotoxicity in cultured renal proximal tubule cells.
Wolff NA; Abouhamed M; Verroust PJ; Thévenod F;
J Pharmacol Exp Ther; 2006; 318 (2):782-91 2006 May 11 PMID:16690719
Cytochrome P450 gene induction in rats ex vivo assessed by quantitative real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (TaqMan).
Baldwin SJ; Bramhall JL; Ashby CA; Yue L; Murdock PR; Hood SR; Ayrton AD; Clarke SE;
Drug Metab Dispos; 2006; 34 (6):1063-9 2006 Mar 10 PMID:16531474

FAQ

What should the starting template DNA quality and quantity be for PCR?

Both the quality and quantity of nucleic acid starting template affect PCR, in particular the sensitivity and efficiency of amplification. PCR sensitivity and efficiency can be reduced by the presence of impurities in nucleic acid preparations or in biological samples. These PCR inhibitors are completely removed when template is prepared using QIAGEN Kits for nucleic acid purification. Please refer to the Brochure "Maximizing PCR and RT-PCR success" for additional information.

The optimal primer–template ratio has to be determined empirically. If too little template is used, primers may not be able to find their complementary sequences. Too much template may lead to an increase in mispriming events. Generally, no more than 1 ug of template DNA should be used per PCR reaction. As an initial guide, spectrophotometric and molar conversion values for different nucleic acid templates are listed below.

 

Spectrophotometric conversions for nucleic acid templates

1 A260 unit* Concentration (ug/ml)
Double-stranded DNA 50
Single-stranded DNA 33
Single-stranded RNA 40

*Absorbance at 260 nm = 1

 

Molar conversions for nucleic acid templates

Nucleic Acid Size pmol/ug Molecules/ug
1 kb DNA 1000 bp 1.52 9.1 x 1011
pUC 19 DNA 2686 bp 0.57 3.4 x 1011
pTZ18R DNA 2870 bp 0.54 3.2 x 1011
pBluescript II DNA 2961 bp 0.52 3.1 x 1011
Lambda DNA 48,502 bp 0.03 1.8 x 1010
Average mRNA 1930 nt 1.67 1.0 x 1012
Genomic DNA      
Escherichia coli 4.7 x 106* 3.0 x 10-4 1.8 x 108**
Drosophila melanogaster 1.4 x 108* 1.1 x 10-5 6.6 x 105**
Mus musculus (mouse) 2.7 x 109* 5.7 x 10-7 3.4 x 105**
Homo sapiens (human) 3.3 x 109* 4.7 x 10-7 2.8 x 105**

* Base pairs per haploid genome

** For single-copy genes

FAQ ID -74
What kind of PCR products can be cloned with the QIAGEN PCR Cloning Kit?

PCR products that will be cloned using the QIAGEN PCR Cloning Kit should be generated using a thermostable DNA Polymerase without proofreading activity, such as Taq DNA Polymerase. Such polymerases attach a single A overhang to their reaction products, which can hybridize to the U overhang of the pDrive Cloning Vector. For efficient addition of an A overhang during the PCR procedure, we recommend a final extension step for 10 min at 72°C as described in the standard protocols of the Taq PCR- and HotStarTaq PCR handbook.


 

FAQ ID -165
Do you have a protocol for polyacrylamide gel analysis of oligonucleotides?
Yes, please follow the Supplementary Protocol 'Polyacrylamide_gel_analysis_of_oligonucleotides' (PCR03).
FAQ ID -961
Is Q-Solution required for PCR with QIAGEN's PCR kits?

Not necessarily. In a lot of cases, the uniquely formulated PCR Buffer provided in the HotStarTag Plus DNA Polymerase, HotStar HiFidelity Polymerase,  Taq DNA Polymerase, HotStarTaq DNA Polymerase, and QIAGEN Multiplex PCR Kits provides optimal amplification of specific PCR products. The usefulness of Q-Solution needs to be determined empirically for each primer/template setup, by running parallel PCR reactions with and without Q-Solution under the same cycling conditions.

Q-Solution changes the melting behavior of DNA and will often improve a suboptimal PCR caused by templates that have a high degree of secondary structure or high GC-contents.  For more details on the effects of Q-Solution on PCR amplification, please see the Q-Solution sections of the HotStarTaq Plus DNA Polymerase, HotStar HiFidelity Polymerase, Taq DNA Polymerase, HotStarTaq DNA Polymerase,  and the QIAGEN Multiplex PCR Handbooks.

FAQ ID -380
Have you tested the effect of inhibitors on PCR performance?

Yes. Please see Table 3 in our brochure Maximizing PCR and RT-PCR success. We tested the effects of different inhibitory substances in a number of PCR systems. We also analyzed the effect of including different volumes of reverse transcription (RT) reaction mixtures in PCR. Please see the table below for a list of commonly encountered template impurities and their inhibitory effects on PCR.

 

Impurities showing inhibitory effects on PCR

Substance Inhibitory concentration
SDS >0.005% (w/v)
Phenol >0.2% (v/v)
Ethanol >1% (v/v)
Isopropanol >1% (v/v)
Sodium Acetate ≥5 mM
Sodium Chloride ≥25 nM
EDTA ≥0.5 mM
Hemoglobin ≥1 mg/ml
Heparin ≥0.15 i.U./ml
Urea >20 mM
RT reaction mixture ≥15%

 

 

FAQ ID -818
How much DNA is obtained in the average PCR reaction?

The DNA yield obtained in a PCR reaction depends on the size of the amplicon, design of the primers, starting amount of template and primers, amplification efficiency, reaction volume, numbers of PCR cycles etc. Therefore it is really difficult to predict what yield to expect. Nevertheless, in our experience, approximately 1 µg is a good guess for most cases.

FAQ ID -750
Can QIAGEN's Taq- and HotstarTaq DNA Polymerases be used for cycle sequencing?
Taq DNA Polymerase and HotStarTaq DNA Polymerase are compatible with cycle sequencing. However, our buffer system is not optimized for this purpose. Optimization of reaction conditions is therefore required when using these Polymerases for cycle sequencing. Unfortunately, we do not have any protocols for this application. An initial activation of the enzyme is necessary if HotStarTaq DNA Polymerase is used.
FAQ ID -741
How can one determine the optimal annealing temperature for a specific PCR assay?

To determine the optimal annealing temperature for a PCR assay, a Temperature Gradient experiment should be performed. To do this, you will set up several PCR reactions in duplicate for the same primer/template combination, using the same PCR chemistry, and subject each of the reactions to a slightly different annealing temperature within a specified range. If a thermal cycler with a temperature gradient function can be used, you can simply program a temperature range for adjacent wells in the cycling block. If no cycler with a gradient function exists in your lab, you will either have to perform duplicate reactions at different temperatures in different machines (if available), or back to back in the same machine.

 

FAQ ID -288