dPCR Copy Number Variation (CNV) Probe Assays

dPCR CNV Probe Assays ermöglichen die spezifische, genaue, reproduzierbare und leicht zu interpretierende Auswertung von Kopienzahlveränderungen für einzelne Gene oder Regionen von Interesse. Assays für mehr als 200 Ziele wurden im Nasslabor mittels PCR validiert und sind in der jeweiligen Assaybeschreibung entsprechend gekennzeichnet.

Darüber hinaus steht ein Tool für die kundenspezifische Assayentwicklung zur Verfügung, um Assay-Anforderungen zu erfüllen, die über das Angebot an Nasslabor-validierten Assays hinausgehen.

Die dPCR CNV Probe Assays sind im Röhrchenformat als gebrauchsfertiger, 20-fach konzentrierter Assay erhältlich. Das Röhrchen enthält das Primerpaar und eine Hydrolysesonde zur Verwendung mit dem QIAcuity Probe PCR Kit (DNA-Ziele), dem QIAcuity Digital PCR System und QIAcuity Nanoplates.

Jeder Assay beinhaltet die Auswahl zwischen verschiedenen Hydrolysesonden (Fluorophoren): Diese Flexibilität ermöglicht die Kombination und Anpassung von Assays zur Multiplex-Analyse von bis zu 12 Zielen in einer einzigen dPCR-Reaktion.

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Hervorragende Assayleistung

Die dPCR CNV Probe Assays bieten eine exzellente Produktamplifikation und Trennung zwischen den negativen und positiven Partitionsclustern in einer Duplex-Analyse unter Einsatz von zwei verschiedenen Konzentrationen des gDNA-Templates (siehe 1D- und 2D-Streudiagramme der Duplex-Reaktionen für KRAS- und TERT-Assays). Die Ergebnisse zeigen, dass eine genaue Analyse von CNVs selbst bei niedrigen Konzentrationen der eingesetzten gDNA durchgeführt werden kann. Die minimalen und maximalen Beladungsmengen für 8.5k-Nanoplatten entnehmen Sie bitte der Erweiterung des QIAcuity-Benutzerhandbuchs. Für die Analyse von bis zu 12 Zielen verwenden Sie bitte das QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kit.

Präzise und reproduzierbare Kopienzahlanalyse mittels digitaler PCR

Das hochreproduzierbare QIAcuity dPCR System und die dPCR CNV Probe Assays ermöglichen eine CNV-Analyse ohne die Notwendigkeit von Replikaten, was den Probendurchsatz auf kostengünstige Weise steigert. Die Duplex-Analyse einer gDNA-Probe ergab die erwartete Anzahl an Kopien pro Genom bei allen Replikaten. In einem Präzisionstest zur Analyse einer gDNA-Verdünnungsreihe zeigen die Assays eine ausgezeichnete lineare Verteilung und Clustertrennung.

Multiplex-Kopienzahlanalyse mittels dPCR

Die Multiplex-Analyse mit den dPCR CNV Probe Assays steigert den Durchsatz und reduziert die Analysekosten je Ziel signifikant. Die Möglichkeit, diese Assays mit verschiedenen Farbstoffen (FAM, HEX, ROX, Atto 550, Cy5 u. a.) zu bestellen, erlaubt ein flexibles Experimentdesign und die Multiplex-Analyse von bis zu 12 Zielen gleichzeitig in einer einzigen Reaktion. Die dPCR CNV Probe Assays zeigen eine ausgezeichnete Amplifikation und Trennung zwischen positiven und negativen Clustern für 12 in einer einzigen Reaktion multiplexierte Assays.

Alle dPCR CNV Probe Assays sind für spezifische Regionen des menschlichen Genoms konzipiert. Die dPCR CNV Probe Gene of Interest Assays zielen auf gut erforschte Krebsgene und krebsassoziierte Gene ab. Die dPCR CNV Probe Reference Assays und dPCR CNV Probe Centromeric Reference Assays umfassen eine Vielzahl von Referenzen mit unterschiedlichen Kopienzahlen je Genom, sodass für jede Analyse die optimalen Normalisierungsreferenzen ausgewählt werden können. Abhängig von den experimentellen Bedingungen können in die Reaktionen mehrere GOI- und Referenzassays aufgenommen werden, um eine genaue Berechnung der Kopienzahl des Gens oder Ziels von Interesse zu ermöglichen.

Die dPCR Copy Number Probe Assays sind gebrauchsfertig: Einfach die einzelnen Assay-Mixe zur DNA-Probe und dem Master-Mix aus dem QIAcuity Probe PCR Kit geben, in die QIAcuity Nanoplate laden und den Lauf auf dem QIAcuity-Gerät starten. Jeder Assay basiert auf der Endpunkt-PCR-Amplifikation einer spezifischen Region von Genen im menschlichen Genom. Das amplifizierte Produkt wird mithilfe zielspezifischer fluoreszierender Hydrolysesonden nachgewiesen, die eine hohe Assay-Spezifität gewährleisten.

Das Prinzip der dPCR-Reaktion in den Nanoplatten finden Sie hier beschrieben.

Die Versuchsansatz ist einfach und unkompliziert und kann in jedem Labor durchgeführt werden, das mit dem QIAcuity dPCR-Gerät arbeitet. Für eine präzisere Kopienzahlanalyse empfehlen wir, nach der Isolierung der genomischen DNA aus der Probe einen enzymatischen Restriktionsverdau durchzuführen. Bei hochfragmentierter DNA (z. B. FFPE-DNA oder zirkulierender DNA) oder cDNA ist ein Restriktionsverdau nicht erforderlich. Um den Restriktionsverdau direkt im Reaktionsgemisch durchzuführen, fügen Sie das empfohlene Restriktionsenzym beim Reaktionsansatz hinzu. Die Verwendung von Restriktionsenzymen, die innerhalb der Zielamplifikations-Region schneiden, ist unbedingt zu vermeiden.

Das fragmentierte Template wird dann mit dem gebrauchsfertigen QIAcuity Probe PCR Kit Master-Mix und dem dPCR CNV Probe Assay gemischt, und dieses Gemisch wird in die einzelnen Wells der dPCR-Vorplatte aliquotiert. Das Reaktionsgemisch wird dann durch Pipettieren gut durchmischt und in die Wells einer QIAcuity Nanoplate überführt. Jedes Gen oder Ziel von Interesse und jeder Referenzassay können durch Kombination mit verschiedenen Fluorophoren in einer Multiplex-Reaktion in einem einzigen Well analysiert werden.

Nach dem Laden und Versiegeln der Nanoplatte wird das empfohlene Cycling-Programm auf dem QIAcuity-Gerät ausgeführt. Die resultierenden Kopienzahlen pro Mikroliter werden im Analysetyp Absolute Quantifizierung der QIAcuity Software Suite angezeigt. Zur Berechnung der Kopienzahl pro Genom wählen Sie in der QIAcuity Software Suite den Datentyp Kopienzahlanalyse aus und definieren Sie die Nanoplatten-Wells für das Gen/die Region von Interesse bzw. die Normalisierungsreferenz. Abhängig vom Cycling-Protokoll können die Ergebnisse des dPCR-Laufs nach ~2 Stunden in der QIAcuity Software Suite analysiert werden.

dPCR CNV Probe Assays eignen sich hervorragend für den genauen Nachweis von Kopienzahlveränderungen oder -variationen an einzelnen Loci unter Verwendung von DNA aus frischen, gefrorenen oder fixierten Proben.