Schnellere Transkriptomerkenntnisse dank leistungsstarker RNA-Sequenzierungslösungen

Die Gesamt-RNA enthält in der Regel nur einen sehr geringen Anteil an kodierender oder funktioneller RNA; ribosomale RNA (rRNA) macht den größten Teil (bis zu 90 %) der RNA in einer Probe aus. Die rRNA muss vor der Sequenzierung aus der Gesamt-RNA entfernt werden, um Ergebnisse von höchster Qualität zu gewährleisten.

Dies wird häufig entweder durch spezifische Depletion der rRNA oder durch selektive Anreicherung von polyadenylierter RNA mittels Oligo-dT-Anreicherung erreicht. Die Depletion von rRNA bewahrt Informationen sowohl über kodierende als auch über nichtkodierende RNA, während die Anreicherung der Poly-A-Fraktion nur kodierende mRNA bewahrt.

Beeinträchtigt die überaus verbreitete rRNA die Sensitivität Ihrer Genexpressions- und Transkriptomforschung, sodass es zu verschwendeten Reads und höheren RNA-Seq-Kosten kommt?

Profitieren Sie von der effizienten Entfernung von > 95 % der unerwünschten rRNA mit der QIAseq FastSelect-Technologie. Unabhängig davon, ob Sie mit RNA-Proben aus Säugetieren, Pflanzen, Hefen oder Bakterien arbeiten und ob es sich um hochwertige, degradierte oder FFPE-RNA-Proben handelt, setzt QIAseq FastSelect neue Maßstäbe für die RNA-Seq –und übertrifft dabei andere Lösungen wie Ribo-Zero, RiboErase und RiboMinus.

Die Gesamt-RNA-seq (RNA-seq des gesamten Transkriptoms) erfasst alle RNA-Spezies in einer Probe, die meist länger als 75 Basen sind, einschließlich mRNA, und identifiziert Gene und Signalwege, die mit biologischen Reaktionen oder fehlender Antwort auf neuartige medikamentöse Therapien sowie mit nicht-kodierender RNA in Zusammenhang stehen. Sie kann die Gen- und Transkript-Häufigkeit genau messen und eignet sich ideal für die Entdeckung neuer Transkripte und alternativer Spleißereignisse über einen breiten dynamischen Bereich. Zu den wichtigsten Anwendungsbereichen zählen die Erforschung krankheitsassoziierter Signalwege, die Identifizierung von Biomarkern, die Klassifizierung von Krankheitssubtypen sowie die Vorhersage und Überwachung der Therapieantwort.

Die Gesamt-RNA-Sequenzierung umfasst vier grundlegende Schritte: RNA-Extraktion, Depletion ribosomaler RNA (rRNA) und Bibliothekserstellung, Sequenzierung und Datenanalyse.

Da Gesamt-RNA-Bibliotheken viele überlappende Sense-/Antisense- und intronische Reads enthalten, bewahrt die Verwendung einer strangspezifischen Chemie zur Bibliothekserstellung (z. B. dUTP-Markierung des zweiten Strangs oder gerichtete Adapterligation) die Transkriptionsorientierung jedes Reads, wodurch eine eindeutige Zuordnung zum richtigen Gen oder zur richtigen Isoform ermöglicht und Mehrdeutigkeiten aufgrund überlappender Transkripte verhindert werden.’

Die QIAseq FastSelect RNA Library Kits verwenden einen einfachen Workflow von weniger als 5 Stunden für eine vollständige Transkriptomik, ausgehend von 1 ng Gesamt-RNA.

Die Messenger-RNA-Sequenzierung (mRNA-seq) umfasst eine hochauflösende Analyse des kodierenden Transkriptoms durch Anreicherung von polyadenylierten RNAs aus der Gesamt-RNA. Dies führt zu einer RNA-Seq-Bibliothek, die einen hohen Anteil proteinkodierender Gene und nur geringe Mengen anderer RNA-Spezies aufweist. Wenn eine RNA nicht polyadenyliert ist, fehlt sie. Die für die Poly-A-Anreicherung erforderliche Probenqualität und -menge können bei Proben mit geringer Eingabemenge oder fragmentierten Proben, wie beispielsweise FFPE-Proben, eine Herausforderung darstellen.

Forschende können mRNA-Anreicherungskits wie das QIAseq Stranded mRNA Enrichment Kit integrieren und die RNA-Seq-Bibliothekserstellung mithilfe der QIAseq FastSelect RNA Library Kits auf proteinkodierende mRNAs fokussieren.

Diese Methode quantifiziert die Genexpression und erkennt bekannte oder neue Isoformen, Genfusionen und allelspezifische Expressionen in verschiedenen Spezies. Durch den Nachweis von Biomarkern auf Transkript-Ebene unterstützt sie die Aufklärung von Krankheitsmechanismen sowie die Arzneimittelentwicklung, die Patientenstratifizierung und die Bewertung der Sicherheit.

Die 3'-RNA-Sequenzierung (3′ RNA-seq) fokussiert auf die Sequenzierung des Poly-A-Schwanzes jedes Transkripts. Herkömmliche Workflows kämpfen dabei mit rRNA-Verschleppungen, fragmentierter RNA oder RNA mit geringer Eingabemenge sowie komplexen, mehrstufigen Protokollen.

Mit den QIAseq FastSelect RNA Library Kits lässt sich 3′ RNA-seq in einem einzigen Reaktionsröhrchen und innerhalb eines Tages durchführen, und liefert selbst aus Proben mit geringer Ausgangsmenge oder aus FFPE-Proben strangspezifische, rRNA-freie Bibliotheken. Es senkt die Sequenzierungskosten (≈1–5 Millionen Reads pro Probe) und ermöglicht dennoch ein Multiplexing mit hohem Durchsatz (bis zu 768 Proben) sowie eine genaue Quantifizierung der Expression auf Gen-Ebene.

Zu den wichtigsten Anwendungen zählen:

• Groß angelegte Studien zur differentiellen Expression, wie z. B. Wirkstoffscreenings, Bevölkerungskohorten, Entdeckung von Biomarkern
• Kostensensible Projekte, bei denen die Hauptfrage lautet, welche Gene hoch- oder herunterreguliert sind
• Klinische/translationale Forschung, bei der Profile von Hunderten von Proben gleichzeitig erstellt werden

Die miRNA-Sequenzierung (miRNA-seq) ist ein gezielter RNA-Seq-Ansatz, der zur Profilerstellung kleiner regulatorischer RNAs wie Mikro-RNAs (miRNAs) verwendet wird. Diese Moleküle spielen eine zentrale Rolle bei der Genregulation und werden zunehmend im Zusammenhang mit Krankheiten untersucht. Genaue Ergebnisse hängen von optimierten Workflows bei der Bibliothekserstellung und der Analyse ab. Bei der Arbeit mit Bioflüssigkeitsproben können geringe RNA-Eingabemengen und hohe Inhibitorkonzentrationen Herausforderungen darstellen. Eine gelfreie miRNA-Seq-Lösung, die mit nur 1 ng Gesamt-RNA kompatibel ist, hilft bei der Bewältigung dieser Probleme und unterstützt den robusten Nachweis differentieller miRNA-Expression. Gewinnen Sie schneller und einfacher neue Erkenntnisse über Krankheiten mit dem RNA Seq Analysis Portal –, einem benutzerfreundlichen, webbasierten Tool, das in den QIAseq miRNA Library Kits enthalten ist.

Die Erstellung von Bibliotheken aus geringen RNA-Eingabemengen kann äußerst problematisch sein, muss jedoch nicht zwangsläufig zu geringer Zuverlässigkeit führen.’ Jeder Arbeitsschritt kann zu einem weiteren Verlust von RNA führen. RNA-Seq Protokolle für geringe Eingabemengen verwenden häufig die Template-Switch-Methode zur Bibliothekserstellung, die eine höhere Sensitivität als herkömmliche ligationsbasierte Methoden gewährleistet. Die QIAseq Low Input RNA Library Kits maximieren die Sensitivität und bewahren die Strangorientierung bereits ab 1 ng Gesamt-RNA. Durch die optionale integrierte rRNA/Globin-Depletion während der reversen Transkription können Sie den Probenverlust minimieren und gleichzeitig in weniger als 5 Stunden saubere, NGS-fertige Bibliotheken erstellen.

Möchten Sie Ihre Projekte mit geringer Eingabemenge hochskalieren? Entdecken Sie, wie Sie mit den QIAseq Low Input RNA Library Kits Ihren Workflow – je nach Anzahl der Proben, Read-Budget und Sequenzierungsplattform – individuell anpassen können.