Verogen ForenSeq MainstAY Kit

• 한 번의 증폭으로 확립된 STR을 가장 많이 조합할 수 있음
• 유럽/SWGDAM 최소 Y-일배체형, CODIS, 인터폴, ESS 요구 사항 충족
• 적은 양의 gDNA 투입으로 전체 프로필 획득
• 뛰어난 균형과 높은 call rate로 까다로운 샘플에서 대립 유전자 검출
• 실행당 96개 샘플 동시 염기서열 분석
• 사건 분석을 위해 국가 DNA 색인 시스템(National DNA Index System, NDIS)에 업로드하도록 승인됨(SE 아님)

주류 사건 분석 및 법의학 유전 계보 확인 검사를 위한 변별력 높은 데이터를 생성하는 가장 접근하기 쉬운 방법인 ForenSeq MainstAY 제품 라인으로 코어 상염색체 및 Y-STR을 타겟팅하십시오. 대부분의 국가 데이터베이스 STR 업로드를 지원하기 위해 특별히 제작된 NDIS 승인 ForenSeq MainstAY Kit 또는 고도의 다형성 SE33 표지자가 포함된 ForenSeq MainstAY SE Kit와 같이 지리적으로 관련된 두 가지 옵션 중에서 선택할 수 있습니다. 일상적인 신원 확인 애플리케이션에 사용되는 확립된 STR에 집중하고 글로벌 데이터베이스와의 호환성을 유지함으로써 MainstAY 제품은 차세대 염기서열 분석으로의 전환을 용이하게 합니다. 친숙하고 입증된 ForenSeq 워크플로우는 2시간 미만의 수작업 시간으로 최대 96개의 증거 샘플에 대한 보다 포괄적인 DNA 프로필을 생성합니다.

ForenSeq MainstAY는 차세대 염기서열 분석(Next-Generation Sequencing, NGS)을 운영 워크플로우에 포함할 수 있는 간편한 전이점을 제공합니다. NGS는 단일 반응에서 다양한 범주의 STR을 동시에 형결정할 수 있도록 지원하므로 법의학 샘플에서 최대한의 정보를 회수할 수 있습니다. 또한 NGS는 STR의 변별력과 추가적인 염기서열 수준의 변이를 결합하여 STR 내의 동종 대립 유전자를 해결할 수 있습니다. ForenSeq MainstAY Kit에는 27개의 상염색체 및 25개의 Y-STR 유전자좌를 소형 앰플리콘으로 증폭하고 MiSeq FGx Reagent Micro Kit를 사용하여 MiSeq FGx Sequencing System에서 염기서열 분석 데이터를 생성하기 위한 시약이 포함되어 있습니다. 이 워크플로우를 사용하면 단일 증폭으로 Au-STR 및 Y- STR의 염기서열 및 대립 유전자 길이 다형성을 모두 식별할 수 있습니다. 이렇게 하면 여러 워크플로우를 실행할 필요가 없으며 법의학 샘플의 정보적 가치를 극대화하여 함유물의 통계적 검증 능력을 높일 수 있습니다. 또한 NGS는 대립 유전자 중첩 문제를 제거하여 사용자가 멀티플렉스에서 더 많은 대립 유전자를 조사할 수 있게 해줍니다.

• STR 유전자좌와 Amelogenin의 조합은 신원 확인에 효과적인 도구입니다
• 전 세계 기존 데이터베이스와의 호환성을 유지합니다
• 1ng gDNA의 적은 권장 투입량으로 재현 가능한 높은 call rate를 제공합니다
• MainstAY Analysis Module로 친숙하고 사용하기 쉬운 인터페이스에서 염기서열 데이터를 분석합니다
• 1.5일 이내에 보고서를 생성합니다

단일 반응에 27개의 Au-STR, 25개의 Y-STR, Amelogenin을 포함하면 대부분의 상용 상염색체 STR 키트보다 높은 예상 가능성 비율을 제공하며, 비교 샘플을 형결정하는 데 사용된 분석법과 관계없이 단일 출처 프로필을 직접 비교할 수 있습니다(예: 데이터베이스 검색 및 국제 데이터 공유에서). ForenSeq MainstAY에서 생성된 유전자 프로필은 Au-STR을 사용한 사건 분석 검색과 Y-STR 데이터베이스를 사용한 일배체형 검색을 가능하게 합니다. Y-STR은 남성 DNA에서 일배체형 프로필을 생성하므로 남성/여성 혼합물로 작업할 때 매우 유용합니다. 남성 기여자가 한 명만 있는 경우 잠재적인 남성 기여자를 제외하는 데 사용할 수 있습니다.

동시에 염기서열 분석할 수 있는 최대 라이브러리 수는 유전자좌당 원하는 판독 수 또는 커버리지 깊이(Depth of Coverage, DoC)에 따라 달라집니다. 앰플리콘 전반에 걸친 균형 잡힌 판독 커버리지도 유전자좌 및 대립 유전자 회수에 매우 중요합니다. ForenSeq MainstAY Kit는 단일 염기서열 분석 반응에서 적은 수의 표지자를 다중화하여 전체 커버리지가 높습니다. 양성 증폭 대조물질, 여성 Coriell 샘플 49개, NTC를 포함하여 46개의 남성 Coriell 샘플에서 얻은 1ng의 투입 DNA로부터 MainstAY 라이브러리를 사용하여 interlocus balance를 결정했습니다. 남성 샘플의 Au-STR과 Y-STR에 대한 평균 커버리지는 각각 669회와 469회 판독이었습니다. 여성 샘플에 대한 Au-STR의 평균 커버리지는 1065회 판독이었습니다. 커버리지 깊이가 가장 깊은 Au-STR과 가장 얕은 Au-STR 간의 배율 차이는 15배, 가장 높은 판독값과 가장 낮은 판독값을 가진 Y-STR 간의 배율 차이는 4.6배(그림 “ForenSeq MainstAY Kit에 포함된 표지자의 평균 DoC” 참조)였습니다. 전체 판독값의 백분율로 표시된 남성 샘플의 interlocus balance 중앙값은 1.9%(Au-STR: 2.2%, Y-STR: 1.6%)였습니다. 여성 샘플의 경우, Au-STR에 대한 interlocus balance는 3.7%였습니다(그림 “ForenSeq MainstAY Kit에 포함된 유전자 표지자의 interlocus balance” 참조).

Intralocus balance(ILB) 또는 이형접합체 평형(heterozygous balance, HB)은 이형접합체 쌍에 대한 더 낮은 대립 유전자 판독 수와 더 높은 대립 유전자 판독 수의 비율로 계산되었습니다. CE 기반 STR에 비해 NGS는 라이브러리 준비 및 염기서열 분석 중에 소형 앰플리콘에 대한 증폭 편향으로 인해 ILB의 범위가 더 넓습니다. 이형접합체 및 동형접합체 유전형 쌍에 대한 ILB는 각 샘플 및 유전자좌에 관한 이 연구에서 1ng DNA 샘플을 사용하여 평가되었습니다. 패널의 모든 표지자는 60% 이상의 ILB 값을 보였으며 ILB 중앙값은 86%였습니다. ForenSeq MainstAY Kit의 커버리지와 낮은 변동성은 앰플리콘의 평형이 잘 잡혀 있어 유전자좌 또는 대립 유전자 탈락 가능성을 줄이고 혼합물에서 소수 기여자의 식별력을 개선한다는 것을 나타냅니다(그림 ”1ng DNA 투입량의 ForenSeq MainstAY Kit에 포함된 유전자 표지자의 intralocus balance” 참조).

다양한 투입량에 걸쳐 유전형과 일배체형을 생성하는 능력은 1ng, 500pg, 250pg, 125pg, 62.5pg, 31.25pg, 15.625pg, 7.82pg의 템플릿 양으로 연속 희석된 gDNA를 사용해 3회 반복하여 평가했습니다. 96개의 라이브러리를 MiSeq FGx Reagent Micro Kit를 사용하여 동시에 염기서열 분석했습니다. ForenSeq MainstAY Kit는 96개의 라이브러리를 동시에 염기서열 분석할 때 62.5pg의 적은 DNA 투입량으로 전체 프로필(대립 유전자 손실 없음)과 100% call rate를 생성하는 높은 수준의 민감도를 제공합니다. 염기서열 분석 기반 유전형 데이터의 대립 유전자 call rate와 비교 정확도를 결정하기 위해, Universal Analysis Software의 MainstAY Analysis Module로 기본 설정을 사용하여 유전형과 일배체형을 생성하고 기존 유전형 분석 방법(STR의 경우 CE 단편 길이 검출)의 직교 유전형 데이터와 비교했습니다. Au-STR은 62.5pg까지 100% 일치하는 것으로 나타났으며, 31pg에서도 95%의 일치율을 보였습니다. Y-STR은 125pg까지 100% 일치했으며, 31pg까지 91%의 일치율을 보였습니다. 모든 불일치 call은 1ng 샘플에 대해 설정된 기본 stutter 필터를 초과한 stutter로 인한 결과였습니다. (그림 “3회 반복하여 증폭된 연속 희석된 gDNA 샘플을 사용한 민감도 연구” 참조).

ForenSeq MainstAY Kit로 생성된 유전형과 일배체형의 일치도를 평가하기 위해 NIST SRM 2391d 표준, Coriell DNA, 양성 증폭 대조물질, 3개의 NTC를 포함한 31개의 라이브러리를 준비하여 3회 반복해 염기서열 분석했습니다. 데이터는 기본 분석 임계값 및 stutter 필터와 함께 Universal Analysis Software의 MainstAY 분석 모듈을 사용하여 분석했습니다. 유전형 및 일배체형 대립 유전자의 정확도는 직교 CE 데이터와 비교하여 결정했습니다. 반복성 및 재현성 실험을 통해 정밀도와 call rate를 측정했습니다. 세 명의 작업자가 세 개의 서로 다른 MiSeq FGx 기기에서 하나의 양성 증폭 대조물질과 세 개의 NTC를 사용하여 15개의 대조물질 DNA 샘플에서 4중으로 라이브러리를 준비하고 염기서열 분석하였습니다. Au-STR(99.82%)과 Y-STR(100%)에서 높은 정확도가 관찰되었습니다. 3261개의 Au-STR 대립 유전자 중 6개의 불일치 대립 유전자가 검출되었습니다. 774개의 Y-STR 대립 유전자에서 불일치하는 대립 유전자는 발견되지 않았습니다. 마찬가지로, Au-STR과 Y-STR의 경우 각각 99.87%와 99.42%의 높은 정밀도가 관찰되었습니다. 모든 불일치는 기본 stutter 필터를 초과하는 stutter 대립 유전자 때문이었습니다.

낮은 수준의 기여자에서 소수의 대립유전자를 검출하는 ForenSeq MainstAY Kit의 능력을 평가하기 위해, 대조물질 여성과 남성 샘플의 혼합물을 1ng으로 생성하고 여성 샘플을 주요 기여자로 설정했습니다. 혼합물에서 소수 기여자의 비율은 50%에서 0.2%까지 다양했습니다. 혼합물에서 공유되지 않은 고유한 소수 대립 유전자 기여 대립 유전자의 수는 기본 분석 및 해석 임계값과 Universal Analysis Software의 MainstAY 분석 모듈의 stutter 필터를 사용하여 평가했습니다(그림 “소수 기여자의 연속적으로 희석된 수준의 여성:남성 gDNA 대조물질 샘플 혼합물” 참조). 50% 소수 기여자에서 31개의 고유한 소수 상염색체 대립 유전자와 27개의 Y 대립 유전자가 검출되었습니다. 약 15개의 고유한 소수 상염색체 대립 유전자(50%의 고유한 Au-STR 대립 유전자)와 26개의 Y 대립유전자가 5%의 소수 기여도로 검출되었습니다. 1%의 소수 기여도에서는 10개 이상의 Y-STR 유전자좌가 검출되었습니다. ForenSeq MainstAY는 낮은 수준의 기여도에서도 혼합물에서 소수 기여자를 효율적으로 식별할 수 있게 해줍니다.

환경 및 화학적 스트레스에 노출된 법의학 샘플을 모방한 부분적으로 분해된 gDNA를 사용하여 ForenSeq MainstAY 워크플로우로 분해된 DNA 샘플의 유전형 및 일배체형을 분석하는 능력을 평가했습니다. 30개의 샘플, 1개의 양성 증폭 대조물질, NTC로부터 1ng의 분해된 혈액 라이브러리를 3회 반복해 준비하여 Miseq FGx Reagent Micro Kit를 사용하여 염기서열 분석했습니다. 라이브러리의 샘플 품질을 평가하기 위해 분해 지수(Degradation Index, DI)를 사용했습니다. DI가 1~4인 샘플은 분해되지 않은 것으로 간주하고, DI가 4~10인 샘플은 중간 정도 분해된 것으로 간주하며, DI가 10을 초과하는 샘플은 심각하게 분해된 것으로 간주합니다. MainstAY로 검사한 샘플의 DI는 1에서 56까지였으며, 분해 정도가 낮은 샘플, 중간 정도 샘플, 분해 정도가 높은 샘플까지 있었습니다. 분해되지 않은 샘플 내의 모든 STR은 정확하게 형결정되었습니다. 중간 정도의 분해도를 보인 샘플은 정확하게 형결정된 STR의 call rate가 85%를 초과하는 반면, 분해가 심하게 일어난 샘플은 call rate가 71%를 초과하여 증폭 가능한 STR의 손실이 최소화되었습니다. DI가 56으로 가장 높은 샘플은 60%의 대립 유전자 회수율을 보였습니다(74개 중 40개). ForenSeq MainstAY를 사용하면 심하게 분해된 샘플에서도 많은 수의 대립 유전자를 검출할 수 있습니다(그림 “분해된 혈액 샘플에서 추출한 유전체 DNA” 참조).

ForenSeq MainstAY 워크플로우는 Verogen 라이브러리 준비 제품군의 기반이 되는 익숙한 ForenSeq 화학 기술을 기반으로 구축되었습니다. 이 민감한 PCR 기반 분석법은 통합된 고유한 이중 색인(Unique Dual Indices, UDI)으로 53개의 표지자를 효율적으로 증폭하여 분해된 DNA에서 대립 유전자를 검출할 가능성을 높이는 짧은 앰플리콘을 생성합니다. 8μL의 DNA 추출 투입량으로 저농도 샘플 및 억제된 샘플의 희석에 유연하게 대응할 수 있도록 도와줍니다.

이 완전 키트형 솔루션에는 양성 증폭 대조물질이 포함되어 있어 손쉽게 구매하고 캘리브레이션할 수 있습니다. 이 키트는 MiSeq FGx Sequencing System의 긴 paired-end 판독 기능을 사용하여 MiSeq FGx Reagent Micro Kit에서 최대 96개의 샘플을 염기서열 분석 및 분석할 수 있어 샘플 처리량을 극대화하고 샘플당 비용을 최소화합니다. 1ng의 적은 gDNA 권장 투입량으로 고품질 단일 출처 샘플부터 62.5pg의 적은 투입량 및 까다로운 샘플까지 전체 프로필을 안정적이고 재현 가능하게 회수할 수 있습니다.

ForenSeq MainstAY Kit는 MiSeq FGx Sequencing System, MiSeq FGx Reagent Micro Kit 및 Universal Analysis Software(UAS)의 MainstAY 분석 모듈과 함께 사용할 경우 30시간 이내에 엔드투엔드 워크플로우를 가능하게 합니다. MainstAY Analysis Module은 가이드 탐색, 프로젝트 및 샘플 보기를 통한 풍부한 시각화, 광범위한 필터링 및 정렬 기능으로 STR 대립 유전자 call에 대한 세심한 검토 기능을 제공합니다. 또한 여러 형식으로 내보낼 수 있는 사람이 읽을 수 있는 보고서를 생성합니다. 이 통합 워크플로우는 법의학 애플리케이션을 위해 NGS를 고려하는 연구실에 비용 효율적인 시작점을 제공합니다.

워크플로우에는 다섯 개의 안전한 정지 시점과 사전 혼합된 어댑터 플레이트가 포함되어 있어 라이브러리 준비의 효율성과 용이성을 높여줍니다. 이 워크플로우는 추출된 gDNA, 조용해물, 보관 배지 카드 펀치(예: FTA) 등 다양한 일반 법의학 DNA 소스와 호환됩니다.

• 대량의 사건 분석을 위한 집중적이고 효율적인 분석

최대 96개의 샘플에 대해 27개의 상염색체 STR과 25개의 Y-STR 표지자를 포함하여 잘 특성화된 최대 규모의 유전자좌 컬렉션을 동시에 조사할 수 있습니다. 최소 100pg으로 기존의 모든 STR 데이터베이스와 호환되는 균형 잡힌 프로필을 생성합니다. 최소한의 상호 작용 분석 모듈로 데이터를 효율적으로 분석하고 지역별 데이터베이스 요구 사항과 호환되는 다양한 업로드 지원 내보내기 옵션 중에서 선택할 수 있습니다.

• 더 나은 데이터, 비슷한 비용

기존 CE 분석과 비슷한 비용으로 한 번의 증폭 및 염기서열 분석 실행을 통해 코어 CODIS 및 유럽 표준 세트(European Standard Set, ESS) STR 유전자좌에 대한 변별력 높은 데이터를 얻을 수 있습니다. 두 가지 염기서열 분석 키트 크기 중에서 선택하여 처리량 요구 사항과 관계없이 차세대 염기서열 분석의 강력한 기능을 활용하십시오.

• 완전 통합 및 지원

엔드투엔드 워크플로우는 확립된 ForenSeq 프로세스를 기반으로 하며, 입증된 단일 플랫폼에서 다양한 범위의 DNA 분석을 가능하게 합니다. ForenSeq MainstAY Kit는 신속한 데이터 평가 및 원클릭 보고서 생성을 위해 UAS와 원활하게 연동됩니다.

Universal Analysis Software(UAS)의 MainstAY 분석 모듈을 사용하면 익숙한 품질 점수, 임계값, 지침을 사용하여 염기서열 분석 데이터를 평가할 수 있습니다. 솔루션 내에서 사전 구성된 분석 설정이 제공되며 필요에 따라 연구실에서 수정할 수 있습니다. 또한 이 모듈은 간소화된 프로젝트 및 샘플 개요를 통해 QC 지표로 표지자를 쉽게 검토할 수 있어 대용량 법의학 연구실의 운영 효율성을 높이도록 설계되었습니다. 새로운 정렬 및 필터링 기능을 통해 사용자는 다양한 QC 지표를 사용하여 STR의 하위 집합을 분류하고 평가할 수 있습니다. 대립 유전자 call과 염기서열 수준 정보를 쉽게 탐색할 수 있으므로 아이소메트릭 이형접합체와 같은 혼합 대립 유전자 집단에서 STR 대립 유전자 염기서열을 더 쉽게 분석할 수 있습니다.

당사는 라이브러리 준비부터 염기서열 분석, 분석에 이르기까지 전체 워크플로우에 걸쳐 탁월한 지원을 제공합니다. 당사의 숙련된 팀이 장비 및 소프트웨어에 대한 포괄적인 서비스 범위, 밸리데이션 계획 및 구현 지침을 제공하여 워크플로우를 쉽게 운영할 수 있도록 지원합니다.