REPLI-g Cell WGA & WTA Kit

細胞や限られた量のサンプルから、全ゲノムおよび全トランスクリプトームを同時増幅

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REPLI-g Cell WGA & WTA Kit (12)

Cat. No. / ID:  150052

REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for parallel 12 x 60 µl whole genome amplification reactions and 12 x 60 µl whole transcriptome amplification reactions (typical yield: 20 µg from each reaction)
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Kit
REPLI-g Cell WGA & WTA Kit (12)
REPLI-g Cell WGA & WTA Kit (48)
REPLI-g Cell WGA & WTA Kitは分子生物学的アプリケーション用であり、疾病の診断、予防、あるいは治療に使用することはできません。

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Features

  • ゲノムDNAおよびRNA(トータルあるいはmRNA濃縮)の同時増幅
  • ゲノム状態と転写パターンの関連付けを容易に実現
  • MDA テクノロジーによるバイアスの無い増幅
  • 細胞あるいは組織からgDNAおよびRNAを直接増幅
  • NGSを含む様々なダウンストリームアプリケーションに使用可能

Product Details

REPLI-g Cell WGA & WTA Kitは均一な全ゲノム増幅(WGA)および全トランスクリプトーム増幅(WTA)を同時に実現し、微量サンプル(25~1000個の細胞)を用いてゲノムとトランスクリプトームを直接関連づけることができます。専用のバッファーおよび試薬は、混入核酸の制御された除去を行ない、REPLI-g法による混入核酸の増幅をブロックします。革新的な溶解バッファーは効果的に細胞核酸を安定化し、ゲノムDNAおよびRNAレベルの両方を正確に提示します。ゲノムDNAおよびトータルRNAあるいはmRNA(poly A+)のバイアスのない増幅は、画期的なMultiple Displacement Amplification(MDA)テクノロジーと斬新なREPLI-g SensiPhi DNA Polymeraseにより行なわれます。PCRベースの増幅テクノロジーとは対照的に、ハイフィデリティー率は1000倍にまで増大し、コストのかかる偽陽性あるいは偽陰性結果を回避できます。

Performance

実験によるばらつきが低く、全トランスクリプトームをカバー
REPLI-g Cell WGA & WTA Kitには画期的なREPLI-g SensiPhi DNA Polymerase、並びに最適化されたバッファーと試薬のセットが入っており、25~1000個の細胞、あるいは同等の少量サンプルから、全ゲノム増幅(WGA)および全トランスクリプトーム増幅(WTA)を同時に行なえます。効率的な細胞溶解(そしてWTA反応ではゲノムDNAの完全な除去後に高感度な逆転写)に続いて、このキットはMultiple Displacement Amplification(MDA)テクノロジーを利用し、gDNAやcDNAの偏りのない完全な増幅を実現します(図 " Multiple Displacement Amplification(MDA)テクノロジー")。 REPLI-g Cell WGA & WTA Kitを用いて増幅したcDNAは実験間で高い再現性を示し、最小限の“テクニカルノイズ(技術上のばらつき)”で高い信頼性のある結果をもたらします(図 “ 高い再現性と作業者間の手技の差異を最小化” )。増幅されたgDNAおよびcDNAは様々なダウンストリームアプリケーションに即使用できます(図 “ REPLI-gで増幅したcDNAおよびgDNAはダウンストリーム実験でgDNAと同様のパフォーマンス" )。

微量サンプルのゲノムおよびトランスクリプトームプロファイルの解析に最適
REPLI-g Cell WGA & WTA Kitは全ゲノムとトランスクリプトームで非常に均一な増幅を実現し、配列の偏りはほとんどありません。25個という少ない細胞数でも、全ゲノムとトランスクリプトームの信頼できる増幅を可能にするため、遺伝子型変化が及ぼすトランスクリプトームへの直接的な因果関係の解析に最適です。(図 “ 同一の限られたサンプルで並行して行なうゲノムおよびトランスクリプトーム解析に最適)。

様々な研究分野で使用可能
REPLI-g Cell WGA & WTA Kitは、細胞からgDNAおよびcDNAを効率的に直接増幅し、腫瘍細胞、幹細胞、選別した細胞あるいはその他の少量サンプルなど、臨床研究で解析される様々なサンプルに使用できます(表参照)。
 
広範なスタートサンプルおよび研究分野
サンプル(細胞/トータルRNA) 研究分野
がん Somatic genetic variant analysis
Tumor progression
Tumor stem cells/evolution
Tumor heterogeneity
Somatic genetic variant analysis
ヒト/動物
バイオマーカー研究(SNP、変異、CNV)
Mosaicism studies
幹細胞研究
Genetic predisposition studies
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Principle

REPLI-g Cell WGA & WTA Kitは微量サンプルからゲノムDNAとトータルRNAを並行した反応で同時に増幅できるように特別にデザインされており、ゲノムとトランスクリプトームの関連付けを直接行なえます。転写制御は環境に応答してゲノムにより引き起こされます。点突然変異、コピー数多型、または構造異常などのゲノムの変異や変動は、種内あるいは生物内での様々なゲノムの多様性を生じます(例、モザイク組織やがん)。いくつかのゲノムの多様性は細胞制御または全身性制御に殆ど影響を与えないこともあります。しかし他の変異が、転写制御や、最終的に生理的に劇的な影響を及ぼす場合もあります。組織の複合的な構造のために、遺伝子型変化が及ぼすトランスクリプトームへの直接的な因果関係に関する解析は、同一細胞で構成される微量サンプルを用いてのみ実施することが可能です。

REPLI-g Cell WGA & WTA Kitは、全ゲノムとトランスクリプトームで非常に均一な増幅を実現し、配列の偏りはほとんどありません。本キットはMultiple Displacement Amplification(MDA)テクノロジーに基づき、DNAテンプレートから解離しないユニークなプロセッシブDNAポリメラーゼを利用し、70 kbまでの複製が可能で、等温でgDNA/cDNA増幅を行ないます(図 " Multiple Displacement Amplification(MDA)テクノロジー")。
 
REPLI-g Cell WGA & WTA Kitのユニークな成分
  • キットに含まれる全ての酵素および増幅用成分は、ユニークで制御された混入核酸除去操作を行ない、REPLI‑gで増幅可能なDNAまたはRNAのコンタミを排除します。このプロセスに続いて、キットの完全な機能性を確実にするために厳格な品質管理が実施されます。
  • ユニークな溶解バッファーは、細胞RNAおよびDNAを効果的に安定化させます。これにより、得られたRNAがin vivoでの遺伝子発現プロフィールを正確に反映し、RNAおよびDNAはインタクトのままで、続く解析のためのゲノムカバレッジを最大にします。
  • すべての酵素反応工程は、正確な増幅のためにRNAあるいはDNAを効率的に処理できるように特別に開発されました。たとえば、これらのプロセスにはRNA増幅のためにcDNA合成前の効率的なgDNA除去および効率的なDNA増幅を確保する酵素によるDNA調製が含まれます。
  • 画期的なREPLI-g SensiPhi DNA PolymeraseがMultiple Displacement Amplification(MDA)に使用されています。これは新しく開発された高アフィニティー酵素であり、反応ミックスにおけるDNA濃度が低い時に特に効率的にDNAに結合します。さらに、PCRをベースにした方法とは対照的に、REPLI-g SensiPhi DNA Polymeraseは、高いプルーフリーディング活性を有しており、取り込みエラーが1/1000になります。この酵素は強力な鎖置換活性も有し、Taqを用いた全ゲノムおよび全トランスクリプトーム増幅方法では作用しない安定したヘアピン構造からもDNAの複製が可能です。
See figures

Procedure

遺伝子解析は大量のgDNAおよびcDNAを必要とすることが多く、サンプル量が非常に少ないために困難な場合が頻繁にあります。唯一の微小サンプルに由来する転写パターンとゲノム状態を相関づける時に、これらのデータを獲得するのも不可能です。全ゲノム増幅および全トランスクリプトーム増幅を並行して行なえばDNA量やRNA量が少なくても、少数の細胞からなる1サンプルを解析することが可能になります。簡単な反応セットアップ、論理的で能率化された操作ステップ、わずか20分の手作業時間、およびgDNAとRNAの同時増幅に反応時間がわずか4時間であることは、REPLI-g Cell WGA & WTA Kit操作が簡単で信頼性の高い方法であることを実証しています。

REPLI-g Cell WGA & WTA Kitには以下のような一連の反応のための試薬が含まれています(図 " REPLI-g Cell WGA & WTA Kit操作手順"):
  • 細胞溶解:シングルセルサンプル(25〜1000個の細胞を含む)は5分以内に効率的に溶解され、RNAあるいはDNAの完全性に影響を与えません。溶解した細胞を等量に二等分します。最初の溶液はWGAに、残りの溶液はトータルRNAあるいはmRNA—濃縮(poly A+)RNAのWTAに使用します。
  • 全ゲノム増幅: 細胞溶解に続いて、分注した一つ溶液のDNAを、高効率のライゲーションのためにモディファイします。ライゲーション反応の特性により、DNAフラグメントは生体内で元々存在していた順序ではライゲートされていません。しかし、このことは、NGS、アレイ解析、qPCRなどのダウンストリームアプリケーションでの核酸配列の検出(例、多型)には影響しません。ライゲーションの後、MDAテクノロジーと斬新な高アフィニティーREPLI-g SensiPhi DNA Polymeraseにより増幅が行なわれます。
  • 全トランスクリプトーム増幅:転写レベルの正確な測定は、gDNAコンタミによる偽陽性結果の排除にかかっているため、細胞溶解の後、WTAを開始する前に2番目の溶液からgDNAを除去します。高効率のライゲーションと増幅のためのcDNAを調製します。その後の逆転写反応用に選択したプライマーにより、トータルRNA濃縮では全転写産物、poly A+ mRNA濃縮ではポリアデニル化転写産物のみが増幅されます。
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Applications

REPLI-g Cell WGA & WTA Kitは微量サンプルからの全転写産物とゲノム領域の均一な増幅を並行して行ないます。キットを用いて並行して増幅されたgDNAとcDNAは、次世代シークエンシング(DNA-Seqおよび RNA-Seqの両方*)、アレイ、ジェノタイピング・アプリケーション、または定量PCRを用いた解析に最適です。

REPLI-g Cell WGA & WTA Kitは以下の増幅に最適です:

トランスクリプトーム(RNA)

  • poly A+ tailをもつmRNA
  • トータル RNA
  • RNA転写全領域
  • mRNAの3’ 末端
  • Lncおよびlinc RNA

ゲノム(DNA):

  • ゲノムDNA
  • ミトコンドリアDNA

小さい核酸には適していません(例)

  • tRNAおよびmiRNA
  • 分解の激しいDNAあるいはRNA

* 次世代シークエンシングを行なう場合、90%以上のリードがrRNAに由来することに留意してください;したがってトータルRNAの増幅後、全トランスクリプトームシークエンシングを実施する際に充分なリードが得られなければなりません。mRNA濃縮(poly A+)RNAを増幅する際には、反応からランダムプライマーを排除することによりrRNAの増幅は起きません。

Supporting data and figures

Resources

MSDS (1)
Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.
クイックスタートプロトコール (1)
キットハンドブック (1)
For parallel whole genome amplification and whole transcriptome amplification from cells and limited samples
Safety Data Sheets (1)
Certificates of Analysis (1)
Kit Handbooks (1)
For parallel whole genome amplification and whole transcriptome amplification from cells and limited samples
Quick-Start Protocols (1)