S_1125_9_TAGZyme_DAPase_Enzyme
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TAGZyme DAPase Enzyme (2.5 U)

Cat. No. / ID:  34362

Für die Aufbereitung von etwa 50 mg markiertem Protein: 2,5 Einheiten DAPase-Enzym, 20 mM Cysteamin-HCl (1 ml)
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645,00 $
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EnzymeVector
TAGZyme Enzyme
TAGZyme pQE Vector
Quantity
2.5 U (1 mL)
50 U (25 mL)
TAGZyme System ist für molekularbiologische Anwendungen vorgesehen. Dieses Produkt ist nicht für die Diagnose, Prävention oder Behandlung einer Krankheit bestimmt.
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Features

  • Exprimierte His-tags, optimiert für die Entfernung durch das TAGZyme Enzym
  • Effiziente Entfernung von His-tags: > 95 % in nur 30 Minuten bei 37 °C
  • Hohe Expressionslevel von Proteinen mit N-terminalem His-tag
  • Hochreine Endprodukte
  • Vollständige Entfernung von Verunreinigungen durch das Ni-NTA-Verfahren

Product Details

TAGZyme DAPase Enzyme enthält ausreichend Enzym für die hochspezifische und effiziente Entfernung von His-tags in bis zu 10 mg Protein mit His-tag. Das TAGZyme System kann zur Entfernung von His-tags bei Proteinen verwendet werden, die einen mit dem TAGZyme Vektor pQE-2 exprimierten intrinsischen DAPase-Stopppunkt enthalten.

Performance

TAGZyme DAPase Enzyme entfernt effizient Dipeptide sequenziell von N-terminalen His-tags bis zu dem mit dem TAGZyme pQE-2-Vektor exprimierten „Stopppunkt“.

Principle

Rekombinante Proteine mit His-tag sind zu wertvollen Werkzeugen für Struktur- und Funktionsuntersuchungen von Proteinen geworden. Aufgrund der geringen Größe und Immunogenität des His-tags muss dieser normalerweise nicht entfernt werden. Für einige Anwendungen, beispielsweise für Strukturbestimmungen mittels Röntgenstrahlen oder NMR sowie für die Herstellung von Therapeutika, sollte das Proteinprodukt jedoch keine vektorbedingten Aminosäuren enthalten.

Der TAGZyme pQE-2-Vektor eignet sich für Proteine mit einem intrinsischen DAPase-Stopppunkt. 

Das TAGZyme System entfernt hochspezifisch und hochwirksam die N-terminalen His-tags rekombinanter Proteine. Mit dem Enzym DAPase werden nacheinander Dipeptide vom N-Terminus des aufgereinigten Proteins mit His-tag abgespalten (siehe Abbildung  „His-tag-Entfernung“”). Sobald das Enzym einen “Stopppunkt” erreicht, d. h. ein Aminosäuremotiv, das nicht als Substrat dienen kann, wird der Verdauprozess gestoppt (siehe Tabelle „DAPase-Stopppunkte“).

DAPase-Stopppunkte

Aminosäure Sequenz* DAPase-Stopppunkt (↓)
Lysin (Lys, K) Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Lys-Xaa...
Arginin (Arg, R) Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Arg-Xaa...
Prolin (Pro, P) Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Xaa-Xaa-Pro-Xaa...
Prolin (Pro, P) Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Xaa-Pro-Xaa-Xaa...
Glutamin (Gln, Q)† Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Gln-Xaa...
Isoleucin (Ile, I) Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Xaa-Ile-Xaa-Xaa...
See figures

Procedure

Bei rekombinanten Proteinen mit intrinsischen Stopppunkten ermöglicht die Expression mit dem TAGZyme pQE-2-Vektor die vollständige und effiziente Entfernung des N-terminalen His-tags unabhängig von der Klonierungsstelle des DNA-Inserts (siehe Abbildung  „His-tag-Entfernung“). Nach der Inkubation mit dem DAPase-Enzym wird das Reaktionsgemisch einer subtraktiven immobilisierten Metall-Affinitätschromatographie (IMAC) mit einer Ni-NTA-Matrix unterzogen (siehe Abbildung  „Aufreinigung von Tag-freien Proteinen“). His-tag-Fragmente und das TAGZyme DAPase-Enzym (das einen C-terminalen 6xHis-tag trägt) binden an die Matrix, und aus der Durchflussfraktion wird reines, Tag-freies Zielprotein gewonnen.

See figures

Applications

Das TAGZyme System bietet eine spezifische Spaltung, den Einsatz rekombinanter Reagenzien und die vollständige Entfernung aller Verunreinigungen und ist damit die Methode der Wahl für die Herstellung His-tag-freier Proteine für Anwendungen wie:

  • Bestimmung der Proteinstruktur durch NMR oder Röntgenkristallographie
  • Herstellung therapeutischer Proteine

Supporting data and figures

Resources

Selection Guides (1)
Vector Sequences & Maps (2)
For the pQE-1 vector
For the pQE-2 vector
Package Insert (1)
Kit Handbooks (1)
TAGZyme Handbook
PDF (2MB)
For exoproteolytic cleavage of N-terminal His tags
Certificates of Analysis (1)

Publications

Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy.
Block H; Kubicek J; Labahn J; Roth U; Schäfer F;
Protein Expr Purif; 2007; 57 (2):244-54 2007 Oct 17 PMID:18053740

FAQ

Is it possible to cleave the 6xHis-tag from an expressed protein?

Yes. In order to cleave off an N-terminal 6xHis tag, a protease cleavage site must be inserted between the coding sequences of the tag and the N-terminus of the protein. Factor Xa Protease recognizes the amino acid sequence Ile-Glu-Gly-Arg and cleaves the peptide bond C-terminal of the arginine residue. The expression vector pQE-30 Xa encodes a Factor Xa Protease recognition site between the N-terminal 6xHis-tag sequence and the multiple cloning site.

If the gene of interest is cloned blunt ended at the 5´-end using the StuI restriction site of the vector, Factor Xa Protease cleavage of the purified recombinant protein results in a protein product without any vector-derived amino acids at the N-terminus.

Tags can also be removed exoproteolytically using the TAGZyme System. This system is an efficient and specific solution for the complete removal of small N-terminal His tags and other amino acid tags by the use of exopeptidases. For detailed information on the procedure please review the TAGZyme handbook.

Please note that both tag removal options work on N-terminal 6xHis tags only.

 

 

FAQ ID -140
Does endogenously expressed DAPase in human cells degrade proteins that are expressed in cell culture?
DAPase (dipeptidyl aminopeptidase I = Cathepsin C), even though endogenously expressed in human tissues and cells, will have only a negligible effect on the degradation of proteins expressed in cell culture. The reason for this is the low level of endogenous DAPase compared to the much higher level of typically overexpressed recombinant protein. However, it is always worthwhile to run a time-course expression experiment to check for possible protein degradation, since proteases and peptidases tend to degrade proteins over time.
FAQ ID -527
How complete is the removal of DAPase in the TAGZyme process?
The removal of DAPase is >99%.
FAQ ID -319
What are the calculated molecular weights of the TAGZyme enzymes?
DAPase: heterodimer, 24 kDa and 6 kDa subunit; Qcyclase: 35 kDa; pGAPase: 28 kDa
FAQ ID -329
Is it possible to store TAGzyme enzymes at°C?
Yes. The TAGzyme enzymes do not experience any loss in function after several freeze and thaw cycles. However, storage at -80°C is not necessary as storage at -20°C is adequate.
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