数字 PCR 应用

使用数字 PCR，您可做些什么？

在当今，数字 PCR——尤其是 QIAGEN 的纳米微孔板技术，正从根本上改变你今天可以问和回答的问题，推动以前受qPCR和其他dPCR技术限制的应用，从而使研究发生革命性的变化。下面的段落介绍了在当前和新兴应用中采用数字 PCR 的益处。

罕见突变检测

罕见突变检测（RMD）是指检测某个仅以极低的频率（低于 1% 甚或 0.1%）存在于野生型背景池中的序列突变。因此，对于诸如点突变或单核苷酸多态性（SNP）等罕见事件的检测和定量，需要采用一种灵敏、准确和精确的方法。相关挑战在于区分两种高度相似的序列，且其中一个序列的丰度显著高于另一个序列。

罕见突变检测的一个示例是检测癌症活检样本中某个低频单核苷酸突变。

大海捞针

检测液体活检中的低频突变就像大海捞针。数字 PCR 可以检测和定量这些罕见分子，并为特定生物标志物发现、早期肿瘤检测和治疗反应监测提供新的机会。基于纳米微孔板的 QIAcuity 数字 PCR系统，凭借其无人值守的工作流程、优异的微分化技术和独特的复孔合并 (hyperwell) 功能，将 dPCR 方法的灵敏性和精确性扩展到即使在最具挑战性的样本中也能找到突变体的一个拷贝。

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拷贝数变异分析

拷贝数变异（CNV）分析可确定某个个体的基因组中每个特定基因的拷贝数。众所周知，每个基因组中的各基因有两个拷贝，然而，这些基因在某些情况下会以更高的频率出现。除了点突变、易位和倒位等基因组改变之外，基因扩增（可激活癌基因）和缺失（可使肿瘤抑制基因失活）是涉及癌症相关基因的重要拷贝数改变（CNA）。大多数受 CNA 影响的癌症相关基因都被定义为参与致癌作用和癌症进展的癌症信号通路中的关键基因。CNV 是基因多样性（基因座的缺失或重复）的重要来源，可供人们研究与常见神经和自身免疫性疾病、遗传因素及药物不良反应相关的基因。

基因表达分析

基因表达分析可同时比较多个基因在两个或更多样本之间的表达水平。该分析可帮助科学家确定表型差异背后的分子基础，并选出靶标基因以进行深入研究。基因表达谱分析可就在正常生物状态及疾病状态下不同的基因表达提供宝贵的见解。

定量 Wolbachia-Nasonia 相互作用

这项工作比较了 qPCR 与 dPCR 在定量 Nasonia 寄生蜂基因表达和 Wolbachia 丰度方面的性能。

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miRNA 表达分析

MicroRNA (miRNA) 表达谱分析可同时比较多个或单个 miRNA 在两个或更多样本之间的表达水平。该分析可协助科学家识别和定量在急性疾病（比如癌症）中作为生物标记物的 miRNA。它可就在正常生物状态及疾病状态下miRNA 表达的作用提供宝贵的见解。

微生物病原体检测

快速、高灵敏度、准确和绝对定量的结合对于公共卫生和流行病学中的病原体检测和微生物组分析至关重要。在研究系统发生以识别、检测、表征和监测病原体及微生物组中的变化时，这些都是必要条件。应用领域广泛，从食品中的病原体、耐药性、微生物研究到抗菌耐药基因调查等。在病原体检测中，微生物病原体通常与病毒同时检测，比如病毒/细菌-宿主关系研究。

媒介传播疾病的识别和定量

这项 QIAcuity dPCR 与 qPCR 比较研究中呈现的结果证明，该方法可实现蚊子中低丰度媒介传播病毒的精确和绝对检测及定量。

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使用 dPCR 进行废水监测

对废水（或污水）进行监测以确定是否存在病原体是一项非常有效的监控方法。由于自然污水具有很高的异质性，且 qPCR 数据可能会因样本稀释不足或存在化学污染而存在高度差异性，人们需要使用一种能够从混合的非靶标背景中鉴别此等罕见靶标核酸分子的方法。使用 dPCR 进行绝对定量可克服这样的差异化问题，降低 PCR 抑制物的影响，并消除使用标准曲线的需求，因此，有助于对这些罕见分子进行准确和灵敏的检测。

预测未来疫情

了解 DPHL 如何采用基于 dPCR 技术的废水流行病学监测方法，提供更全面的社区COVID-19疾病流行情况，并为公共卫生决策提供信息。

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病毒载量定量

病毒载量测定测量生物样本中特定病毒的数量。结果报告为每毫升样本中病毒 RNA 的拷贝数。病毒载量测定可用于诊断急性病毒性感染，指导治疗选择以及监测对药物治疗的反应。

数字 PCR 用于人唾液 SARS-CoV-2 检测

阅读有关 QIAcuity 数字 PCR 的使用的应用注解，在该注解中，dPCR 被用作 qPCR 的替代方案，以对非侵入性取样获得的唾液标本中低水平的病毒及其变异体进行精确的、更灵敏和高频度的检测。

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液体活检

液体活检又称为液态活检，是指对非实体生物组织（主要是血液）的取样和分析。它主要用作癌症等疾病的诊断和监测。与组织活检相比，液体活检对供体的创伤性更小。当肿瘤细胞死亡时，它们会将 ctDNA 释放到血液中。ctDNA 中的肿瘤突变可反映在传统肿瘤活检中发现的突变，因而可被用作分子标记物以追踪疾病情况。相关挑战在于血液中来自肿瘤细胞的 ctDNA 浓度非常低。金标准是使用 NGS、焦磷酸测序或 real-time PCR，但这些方法的缺点一直在于 LOD 的局限性。肿瘤组织焦磷酸测序的 LOD 大约为 10%，NGS 为 1–5%，而 qPCR 的检测限可低至 1%。由于检测水平的限制，这会造成供体残留疾病监测期间复发的问题。

通过 dPCR 进行 cfDNA 突变分析

文章介绍了两项技术的威力：一项从大体积样本处理开始并以超低频突变检测结束，从而产生可靠结果的工作流程。

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GMO 检测

基因改造生物（GMO）常用于代指转基因作物。基因工程是一种引入某些想要的特征的技术，这些特征比如病毒/昆虫耐受性、更高的作物产量、增强的成分组成等等。GMO 检测可以是定性（是否存在）或定量（GMO 的量）的。它可以是事件特异性的，即检测某个特定 GMO 独有的 DNA 序列的存在与否；也可以是构建特异性的，即检测插入到某个 GMO 中的某个外来 DNA 序列。对于很多作物生产商/出口商/进口商而言，进行 GMO 鉴定是满足监管规定所需。real-time PCR 是当前的惯用方法，但它在检测和定量复杂食物/饲料基质中常见的低含量 DNA 靶标时具有局限性。

基因组编辑检测（CRISPR-Cas9）

在基因编辑研究中，诸如锌指核酸酶（ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）经常被用于细胞的基因组编辑。这些核酸酶可产生位点特异性 DNA 双链断裂（DSB），而这些断裂可通过不精确、易出错的非同源末端连接（NHEJ）（供体模板/精确点突变）或同源定向修复（HDR）途径进行修复，从而导致靶向突变。因而，可生成一个由具有非均质 Indel 错误和不同等位基因编辑频率的细胞组成的混合群体。随后，将测定所需基因座上的基因组编辑频率。克隆细胞系以分离出单个细胞，随后检测这些细胞以确认基因组编辑事件。

NGS 文库定量和验证

在当今，可采用不同的方法进行 NGS 文库定量和验证。在对生成的文库进行准确定量方面，使用分光光度法系统及 qPCR 有其局限性。获取文库的准确浓度对于经济有效且准确的测序运行而言至关重要。直到当前，real-time PCR 一直是验证测序运行的金标准。其缺点是，当需要验证文库中低于 1% 的结果时缺乏精确性。

dPCR 和 NGS：搭配使用效果更好？

了解这两种技术，包括它们的优势、局限性和互补性，以及如何使用 dPCR 进行 NGS 文库定量。

残留宿主细胞 DNA 定量

残留宿主细胞 DNA（HCD）是在生产治疗性蛋白药物和疫苗的过程中携带的 DNA。可接受的水平由监管机构（比如美国食品和药品监督管理局和世界卫生组织）确定。数字 PCR 残留 DNA 定量试剂盒是高度精确定量复杂生物工艺中 HCD 的理想选择。在基因疗法、基于细胞的疫苗及类似生物疗法或其他疗法的开发过程中，需清除的细胞可能是 HEK293、CHO 或 E. coli。

如何降低细胞和基因治疗的风险

探索精心设计的数字 PCR assay 如何将质量控制提升到一个新的水平，从而实现更为安全的生物制造。