使用数字 PCR，您可做些什么？
无论您是处理珍贵样本、分析罕见突变还是研究充满抑制剂的样本，纳米微孔板 dPCR 都能提供精确、可重复的数据。快速、自动化的工作流程大大降低了可变性，提高了一致性，而且非常简单，只需很少的培训即可掌握。
数字 PCR，特别是 QIAcuity 上的纳米微孔板 dPCR，正从根本上改变您今天可以提问和回答的问题，从而使研究发生革命性的变化。该方法正在推动以前受 qPCR 和其他 dPCR 技术限制的应用。看看该技术能为您的非临床应用做些什么。
对数字 PCR 的临床应用感兴趣？在此处了解更多。
罕见突变检测
罕见突变检测（RMD）是指检测某个仅以极低的频率（低于 1% 甚或 0.1%）存在于野生型背景池中的序列突变。因此，对于诸如点突变或单核苷酸多态性（SNP）等 罕见事件的检测和定量，需要采用一种灵敏、准确和精确的方法。相关挑战在于区分两种高度相似的序列，且其中一个序列的丰度显著高于另一个序列。
使用纳米微孔板 dPCR 检测罕见突变的益处
- 能够将大型输入反应体积加载到 26,000 个分区中，这大大增加了找到罕见靶标的机会
- 对突变体和野生型测序进行多重检测，在丰富的野生型背景下检测低分数的罕见突变体分子
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拷贝数变异分析
拷贝数变异（CNV）分析可确定某个个体的基因组中每个特定基因的拷贝数。众所周知，每个基因组中的各基因有两个拷贝，然而，这些基因在某些情况下会以更高的频率出现。除了点突变、易位和倒位等基因组改变之外，基因扩增（可激活癌基因）和缺失（可使肿瘤抑制基因失活）是涉及癌症相关基因的重要拷贝数改变（CNA）。大多数受 CNA 影响的癌症相关基因都被定义为参与致癌作用和癌症进展的癌症信号通路中的关键基因。 CNV 是基因多样性（基因座的缺失或重复）的重要来源，可供人们研究与常见神经和自身免疫性疾病、遗传因素及药物不良反应相关的基因。
使用纳米微孔板 dPCR 进行 CNV 分析的益处
- 检测 CNV 变化小于 1.2 倍，约 2 小时内得出结果
- 利用 8.5K Nanoplate 提高 dPCR CNV 分析的经济性和通量水平，利用 26K Nanoplate 提高多重检测能力或更精细地分辨连续拷贝数状态
- 使用 QIAcuity Software Suite 自动计算 CNV，并可设计定制检测方法
液体活检
液体活检又称为液态活检， 是指对非实体生物组织（主要是血液）的取样和分析。它主要用作癌症等疾病的诊断和监测。与组织活检相比，液体活检对供体的创伤性更小。当肿瘤细胞死亡时，它们会将 ctDNA 释放到血液中。ctDNA 中的肿瘤突变可反映在传统肿瘤活检中发现的突变，因而可被用作分子标记物以追踪疾病情况。相关挑战在于血液中来自肿瘤细胞的 ctDNA 浓度非常低。金标准是使用 NGS、焦磷酸测序或 real-time PCR，但这些方法的缺点一直在于 LOD 的局限性。肿瘤组织焦磷酸测序的 LOD 大约为 10%，NGS 为 1–5%，而 qPCR 的检测限可低至 1%。由于检测水平的限制，这会造成供体残留疾病监测期间复发的问题。
使用纳米微孔板 dPCR 进行液体活检分析的益处
- 使用 QIAcuity Nanoplate 26K 最多可装载 28 µl 样品，以提高 LOD 并最大限度地减少取样误差 – 使您能够生成更多的数据点，以确保表达的微小变化或残留疾病的监测
- 检测低至 0.01% 变异等位基因频率的超罕见突变
- 由于 dPCR 测量不受扩增效率的影响，因此可处理全血和尿液等更粗狂的样本
微生物检测
传染病和流行病的爆发越来越普遍，这凸显了改进微生物（尤其是病原体）检测和分析的必要性。快速、高灵敏度、准确和绝对定量的结合对于公共卫生和流行病学中的病原体 检测和微生物组分析至关重要。数字 PCR 是一种快速、灵敏和精确的方法，对识别、检测、表征和监测病原体和微生物组的变化大有裨益。dPCR 在微生物检测中的应用领域包括食品中的病原体、耐药性、微生物研究、 抗菌耐药基因调查以及病毒/细菌-宿主关系分析。
纳米微孔板 dPCR 用于微生物检测的益处
- 即使是复杂样本或含有大量抑制剂的样本，也能对微生物物质进行精确和绝对地定量
- 为了提升灵敏度，可采用 Nanoplate 26K 以采用更大的样本体积（最多 28 µl），并检测低于其他商业检测方法检测限的靶标
- 最多可多重检测 12 种检测方法，可选择定制设计的检测方法或 700 多种微生物靶标（细菌、病毒、毒力因子、AMG 等）目录检测方法。
病毒载量定量
病毒载量测定测量生物样本中特定病毒的数量。结果报告为每毫升样本中病毒 RNA 的拷贝数。病毒载量测定可用于诊断急性病毒性感染，指导治疗选择以及监测对药物治疗的反应。
使用纳米微孔板 dPCR 检测毒力基因的益处
- 使用 Nanoplate 26K 检测低丰度基因，这样可允许对每个样本进行更高程度的微分化，并采用更大的样本加载量
- 能够分析微生物和病毒靶标，仅对感兴趣的序列进行高度特异性检测
- 通过在一次反应中对多达 12 个靶标进行多重检测，实现准确高效的分析
细胞和基因治疗
数字 PCR 技术实现了一系列的基因治疗应用，包括腺相关病毒载体基因组滴度、慢病毒载体拷贝数定量以及 CAR-T 细胞治疗开发和生产。这对于在确保患者安全的同时开发有效且可重复的细胞和基因治疗至关重要。
病毒滴度测量
了解 QIAcuity dPCR 如何以更高的速度、通量和可扩展性，在病毒滴度定量中产生与传统 ddPCR 方法相同的准确性和精确性。了解从病毒载体裂解到残留 DNA 定量，再到载体基因组滴定 和基因组完整性测定的完整工作流程，准确性、重复性和速度都非常出色。
使用纳米微孔板 dPCR 测定 AAV 滴度的益处
- 通过我们的专用试剂盒进行高效的衣壳裂解和残留 DNA 清除，可稳定可靠地测定最终滴度
- 减少错误，使用一个方案即可轻松实施，只需最少的手动步骤和 10 分钟的动手时间
- 多达 10 种不同染料组合的单靶标检测多重检测技术，可提高检测的准确性和灵活性； 还可通过感兴趣基因 (GOI) 检测扩展到 12 重能力
- 利用我们先进的 QIAcuity 软件功能，可同时使用多达 12 个靶标对基因组完整性进行精确评估
残留宿主细胞 DNA 定量
残留宿主细胞 DNA（HCD）是在生产生物制药产品的过程中携带的 DNA。可接受的水平由监管机构（比如美国食品和药品监督管理局和世界卫生组织）确定。数字 PCR 残留 DNA 定量试剂盒是高度精确定量复杂生物工艺中 HCD 的理想选择。基因疗法、治疗性蛋白和其他生物疗法开发过程中常用的宿主细胞包括人胚肾 293（HEK293）、仓鼠卵巢 (CHO) 和 E. coli。
使用纳米微孔板 dPCR 进行残留宿主细胞 DNA 定量的益处
- 由于采用了预混液和阳性/内部对照，因此易于设置和检测宿主细胞 DNA
- 准确检测 E. coli、CHO 和 HEK293 的残留 DNA，即使在存在 PCR 污染物和抑制剂的情况下，也能在较低的量下得到检测结果
- 多拷贝物种特异性靶标检测可确保结果不受 resDNA 碎片化水平的影响
- 使用经 dPCR 验证的标准品，可进行定量准确性验证或桥接研究
支原体检测
支原体是生物制药行业中细胞系生物制品的污染物。支原体可能由于源细胞系本身（细胞基质）受到污染或在生产过程中偶然引入支原体而出现在细胞培养物中。关于生物制品生产中支原体安全性的多种污染风险指南和技术文件可供参考。
数字 PCR 可用于检测细胞培养物和其他源自细胞培养物的生物制品中的污染。例如，QIAcuity Mycoplasma Quant Kit 是一种 RT-dPCR 试剂盒，可检测 rRNA 和 DNA，从而实现方法高灵敏度。内部扩增对照可防止由于 PCR 抑制剂、RNA 提取不当或 RT 反应不当造成的假阴性。这种基于探针的检测方法可以对 127 种不同的支原体进行定量和检测。
使用纳米微孔板 dPCR 检测支原体的益处
- 合规：符合欧洲、美国和日本药典的支原体检测 NAT（核酸技术）工作流程
- 快速：无需耗时培养支原体
- 灵敏：由于单个细菌细胞中存在多个拷贝（检测 < 10 CFU/mL），因此检测 rRNA 比仅检测 DNA 具有更高的灵敏度。如果跳过 RT 步骤，该检测方法仍能检测 DNA，因此具有高度灵活性。
- 已预先验证：作为全面验证报告的一部分，该工作流程已经过广泛测试，可减少您自己的验证工作
- 10 个支原体标准 CFU 试剂盒，用于内部验证或作为 阳性对照，不引入重要支原体
miRNA 表达分析
MicroRNA (miRNA) 表达谱分析可同时比较多个或单个 miRNA 在两个或更多样本之间的表达水平。该分析可协助科学家识别和定量在疾病（比如癌症）中作为生物标记物的 miRNA。它可就在正常生物状态及疾病状态下miRNA 表达的作用提供宝贵的见解。
纳米微孔板 dPCR 用于 miRNA 表达分析的益处
- 利用 dPCR 的高特异性识别序列密切相关的 miRNA 的单核苷酸差异
- 微妙 miRNA 表达变化的绝对定量，尤其是在模板量较低的情况下
食品检测
多重数字 PCR 检测在食品工业中有着广泛的应用，包括监管控制、质量保证、GMO 检测、食品欺诈检测和食源性疾病监测。这些检测方法可以鉴别动物种类并追溯肉制品的来源，例如在一次反应中就能区分猪、骆驼、绵羊、驴、山羊、牛和鸡。它们还可用于 GMO 检测中的转基因定量，研究表明，与 qPCR 相比，它们具有更高的灵敏度和可重复性。在检测食品欺诈方面，dPCR 检测方法可通过靶向特定线粒体和叶绿体 DNA 标记，识别素食或素食产品中的动物来源成分。此外，dPCR 还能有效地同时检测多种微生物病原体，如 E. coli、L. monocytogenes、S. aureus 和 S. enterica，从而确保食品安全和质量。
使用纳米微孔板 dPCR 进行食品检测的益处
- 多重检测和 dPCR 能够最大程度地降低因参照材料和样本的基质不同而导致的扩增效率不同的影响，因此是复杂基质样本的理想选择
- 采用 8 块板系统和多重检测，可提供高通量选项
- 因微分化作用降低背景信号，可对罕见 GMO 事件进行可靠的检测
单细胞分析
与分析大量细胞群的传统方法相比，单细胞分析可以获得单细胞水平的数据，帮助研究人员更好地了解细胞异质性、生物功能、过程和疾病机制。常用的单细胞分析方法，包括 PCR、qPCR 或新一代测序（NGS），有时缺乏检测感兴趣靶标所需的灵敏度。
数字 PCR 是一种新兴的单细胞分析选择，因为 dPCR 平台具有成本效益高、直观、准确的特点，可实现高通量、高检测灵敏度和高精确度。
使用纳米微孔板 dPCR 进行单细胞分析的益处
- 高度精确的物理分区比液滴更稳定
- 基于探针的检测允许在单个 dPCR 反应中对多达 12 个靶标进行多重检测，只需进行最少的优化即可
- 精确的结果可在单细胞水平上分析低丰度靶标和多拷贝靶标
基因组编辑检测（CRISPR-Cas9）
诸如锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）和 成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）经常被用于细胞的基因组编辑。这些 核酸酶可产生位点特异性 DNA 双链断裂（DSB）， 而这些断裂可通过不精确、易出错的非同源末端连接（NHEJ） （供体模板/精确点突变）或同源定向修复（HDR）途径进行修复，从而导致靶向突变。因而，可生成一个由具有非均质 Indel 错误和 不同等位基因编辑频率的细胞组成的混合群体。随后，将测定所需基因座上的 基因组编辑频率。克隆细胞系以分离出单个细胞， 随后检测这些细胞以确认基因组编辑事件。
使用纳米微孔板 dPCR 进行基因组编辑检测（CRISPR-Cas9）的益处
- 具有更高的灵敏度，可检出频率为 0.5% 的编辑事件
- 可采用低至 5 ng 的总 gDNA 材料对编辑事件进行绝对定量
- 可区分克隆种群中的纯合子和杂合子编辑
NGS 文库定量
下一代测序文库定量是充分利用流程池的必要步骤。有证据表明，在文库定量不准确的情况下，NGS 文库过载或欠载都会对数据输出和质量产生不利影响。使用数字 PCR 来确定 NGS 文库池的绝对浓度对获得最佳产量和降低每个样本的成本大有裨益。
使用纳米微孔板数字 PCR 进行 NGS 文库定量的益处
- 可扩增文库片段的绝对 定量，无扩增偏差，无 标准偏差，2 小时得出结果，适合 常规测试
- 重现性高、均匀性好， 只需一次检测即可覆盖 所有 Illumina 文库类型的文库池
蛋白质定量和相互作用
Actome 的蛋白相互作用偶联 (PICO) 技术得益于 QIAcuity Digital PCR System，为检测和定量单个蛋白质和蛋白质相互作用提供了一种高度通用和灵敏的方法。PICO 技术可将复杂的蛋白质状态转化为 DNA 条形码，以便使用 dPCR 进行扩增和检测。此方法非常有用，特别是在研究细胞通路、寻找蛋白质生物标记物、开发药物研究新检测方法或进行多组学分析时。
使用纳米微孔板 dPCR 检测蛋白质的益处
- 市面上唯一使用 dPCR 定量蛋白质的技术
- 在单细胞水平检测蛋白质、蛋白质间相互作用和翻译后修饰
