QIAcuity Residual DNA Quantification Kits

QIAcuity Digital PCR Systemを用いて、より高い精度と正確さで宿主細胞DNAのキャリーオーバーを確認

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E. coli resDNA Quant Standard Kit

Cat. No. / ID:   250221

E. coli resDNA Quant Standard (1x)、再水和バッファー
¥120,000
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Kit
resDNA Quant Standard
resDNA Quant
Cell type
E. coli
CHO
HEK293
QIAcuity Residual DNA Quantification Kitsは分子生物学的アプリケーション用であり、疾病の診断、予防、あるいは治療に使用することはできません。

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特徴

  • 宿主細胞DNAのセットアップと検出を容易にするコントロール付きプレミックスマスターミックス
  • E.coli、CHO、HEK293細胞から、残存宿主細胞DNAを、フェムトグラムレベルまで正確に検出可能
  • 高度に断片化された宿主細胞DNAを検出および定量するマルチコピーターゲットアッセイ
  • 抽出サンプルと未抽出サンプルの両方で宿主細胞DNA検出が可能

製品詳細

ワクチン、医薬品、その他のバイオ医薬品などの製品の宿主細胞DNAコンタミネーションは、大きな健康リスクをもたらします。そのため、その安全限界は米国FDAやWHOなどの機関によって厳しく規制されています。残存DNAの上限に関する明確なガイドラインは、薬剤投与の性質、汚染細胞DNAの感染性および発がん性に基づいて規定されています。例えば、非腫瘍原性細胞DNAの非経口投与は、投与1回あたり10 ng、最大長200 bpに制限すべきですが、経口投与されるワクチンでは、WHOにより、残存DNAは1投与当たり100 µg未満にするよう推奨されています。 


製造中の製品のこのようなコンタミネーションの検出と除去には、製品中に存在する極微量の特異的宿主細胞DNAを高感度かつ正確に定量する必要があります。


デジタル PCRは、残存DNA定量に適した検出方法です。これは、リアルタイム PCRのような他の検出法と比較して、特に微量レベルのコンタミネーションでは、比類のない感度と精度を有しているからです。QIAcuity Residual DNA Quantification Kitsは、Escherichia coli (E.coli)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)およびヒト胎児腎293細胞(HEK293)の宿主細胞DNAを正確かつ高精度で検出します。     

 

パフォーマンス

QIAcuity Residual DNA Quantification Kitsは、PCR時のコンタミネーションやその他の阻害試薬が存在する場合でも、抽出の有無にかかわらず、CHO、E.coli、HEK293の残存DNA(resDNA)の正確な定量を行い結果を示します。このアッセイは、高度に断片化された残存宿主細胞DNAを正確に測定するマルチコピーターゲットアッセイです。

  

アッセイ ターゲットコピー数 アンプリコンサイズ cp/µlからfg/µlへの変換係数
QIAcuity E.coli resDNA Quant Kit 7 <200 0.35
QIAcuity CHO resDNA Quant Kit ~100万、未定義(繰り返し要素) <100 0.28
QIAcuity HEK293 resDNA Quant Kit ~100万、未定義(繰り返し要素) <100 1.54

 

QIAcuity E.coli resDNA Quant Kitは、1回の反応でわずか5 fgの残留DNAを検出します

1反応あたりのロード量(fg/rxn) E.coli Standard(コピー/µl) 内部コントロール(コピー/µl)*
50000 2949.7 99.9
5000 291.6 91.7
500 27.6 91.4
50 2.8 93.2
25 1.46 92.5
5 0.45 90.6
NTC 0 98.9

*内部コントロールには100コピー/µlが予想される

デジタルPCRは、リアルタイム PCRよりも少ないテンプレートインプット濃度で、より高い検出感度を示すため、安定したアプリケーションが可能になります。

QIAcuity CHO resDNA Quant Kitは、1回の反応でわずか5 fgの残留DNAを検出します

1反応あたりのロード量(fg/rxn) CHO Standard(コピー/µl) 内部コントロール(コピー/µl)*
50000 4939.3     108.7
5000 508.3     104.9
500 50.2     97.6
50 4.7 99.5
25 2.6 101.3
5 0.6 100.4
NTC 0 104.7

*内部コントロールには100コピー/µlが予想される

QIAcuity HEK293 resDNA Quant Kitは、1回の反応でわずか5 fgの残留DNAを検出します

1反応あたりのロード量(fg/rxn) HEK293 Standard(コピー/µl) 内部コントロール(コピー/µl)*
50000 1104.9 96.6
5000 104.5 92.5
500 8.83 92.4
50 0.99 94.4
NTC 0 96.2

*内部コントロールには100コピー/µlが予想される

このキットは、QIAcuityデジタルPCRシステムおよびQIAcuity Nanoplatesと連動して作動し、リアルタイムPCRと同等のエンドツーエンドの高速dPCRワークフローを提供しながら、サンプル中のresDNAを絶対定量することができます。このキットは、バイオプロセス製造とQCの要件を念頭に置いて設計されています。

 

原理

ナノプレートでのdPCR反応の原理はこちらで説明しています。

宿主細胞DNAモニタリングにQIAcuity デジタルPCR を使用すると、QIAcuity Nanoplate 26kの性能により、バルクサンプルのパーティショニングによってLoD/LoCが向上します。パーティショニングによってターゲットの有効濃度が上昇するので、少量の宿主細胞 DNAをより高い精度と正確さで捕捉すること、測定することができます。QIAcuity Nanoplate 26kでは、多くのテンプレートインプット量をロードすることができます。パーティション数の増加が、残存宿主細胞検出の精度と正確さが向上する理由の一つになります。

  

 

操作手順

溶解物を、内部コントロールおよび絶対定量によって測定する宿主細胞DNAとともに、残留定量アッセイに追加します。コピー/µlを提供されている変換ファクターでfg/µlに変換します。

アプリケーション

QIAcuity Residual DNA Quantification Kitsは、複雑なバイオプロセス中間体中の宿主細胞DNAの高精度定量に理想的です。

裏付けデータと数値

FAQ

What does the standard kit contain?
The standard for HEK293, CHO, and E. Coli contains genomic DNA, and we recommend digestion of the standard for better migration out into the partitions.
FAQ ID - 3938
dPCR results are in copies per microliter. How do I calculate host cell DNA contamination in femtogram per microliter?

The conversion factors from copies per microliter to femtogram per microliter for each target assay (E. coli, CHO, and HEK293) will be provided in the quick-start protocol and the QIAcuity User Manual Extension: Application Guide.

FAQ ID - 3876
My samples are highly fragmented. Is the dPCR result for resDNA quantification accurate?

ResDNA Quant Kit (E. coli, CHO, and HEK293) assays are multicopy target assays that ensure quantification of  resDNA unaffected by the fragmentation level. In addition, short amplicon regions are selected for each target region. 

FAQ ID - 3877
Is DNA extraction from the samples needed?

No. DNA extraction is not required. However, if the samples contain high levels of PCR inhibitors or high protein concentration, DNA extraction is recommended for accurate quantification of ResDNA contamination.

FAQ ID - 3873
What is the amount of standard for the different kit?
The standard that is provided has an amount of 1000 pg that will be diluted with 100 µL of rehydration buffer down to working solution of 10 pg/µL.
FAQ ID - 3936
Is restriction enzyme digestion required?

Restriction digestion of the templates is required when the template length exceeds 20 kb for a better distribution of templates within partitions. Recommended restriction enzymes can be found in the applications guide and quick-start protocols.

FAQ ID - 3875
Which extraction kits are recommended?

QIAamp UCP DNA Micro Kits, QIAamp HMW MagAttract Kits, QIAsymhony DSP Kits, QIAsymphony Certal Kits, and DNeasy Blood & Tissue Kits are few recommended extraction kits to combine with ResDNA Quant Kit.

FAQ ID - 3874
What is the preferred storage temperature for reconstituted assay for the QIAcuity HEK293 resDNA Quant Kit (96)?
The recommended storage temperature is 4°C for 72 hours.
FAQ ID - 3935
Is dPCR sensitive to inhibition?

dPCR is less prone to inhibition in comparison to qPCR; however, we recommend dilution of samples that are known to contain PCR inhibitors.

FAQ ID - 3880
How much sample can I load for detecting host cell contamination?

26k Nanoplates are recommended for resDNA quantification, which maximizes the amount of template that can be loaded within a single reaction. In 26k nanoplates, this corresponds to 28 μl in 40 μl reaction volume. In addition, maximum template loading amounts for each kit will be provided in QSPs. 

FAQ ID - 3879
What are the ResDNA Quant Kit components?

The kits are composed of a premixed master mix for CHO and E. coli in liquid format that contains the target. For HEK293 the same composition comes in lyophilized format. The kit also contains an internal control assay detected in Green and Yellow channel, internal control DNA, positive control DNA, and dPCR qualified water. All necessary components are included in the ResDNA Quant Kits.

FAQ ID - 3878
How long can I store the reconsituted assay regarding QIAcuity HEK293 resDNA Quant Kit (96) at 4°C?
For optimal performance, the recommendation is to use the reconstituted assay within 72 hours.
FAQ ID - 3934
What region is targeted in the QIAcuity E. coli resDNA Quant Kit (96)?
The QIAcuity E. coli resDNA Quant Kit (96) is targeting the transcribed genomic regeion of 16S with <200 bp fragment size. 
FAQ ID - 3939
How did you calculate the conversion factor?
A serial dilutions of HEK293, CHO, and E. Coli gDNA standard test them using HEK293, CHO, and E. Coli ResDNA Quant Kits, respectively. We then compare the copies per microliter obtained at different loading concentrations. We correlate the number of copies of target amplicon with the loading amount in picogram. To rule out any issues with PCR performance, loss of target amplicons, loading errors, user error, instrument errors, etc. skewing the true conversion factor, we repeat the testing over multiple samples, multiple batches of kits, standards, and multiple users. This gives us our accurate conversion factor.
FAQ ID - 3937