デジタルPCR用miRCURY LNA miRNA Custom PCR Assays

miRCURY LNA miRNA Custom PCR Assaysは、非常に高感度で特異的なmiRNAの定量を可能にするカスタム設計のmiRNA PCRプライマーセットです。フォワードおよびリバースPCR増幅プライマーはいずれもmiRNA特異的であり、LNA技術で最適化されています。アッセイはチューブ形式で提供され、Nanoplate 8.5kでは166回の反応（1回の反応あたり12 μl）、Nanoplate 26kでは50反応（1回の反応あたり40 μl）に十分なプライマーを含んでいます。上流のcDNA合成ステップはmiRCURY LNA RT Kitで行われ、デジタルPCR増幅はQIAcuity EG PCR Kitを使用してQIAcuity装置で行われます。

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QIAcuity EG PCR KitとQIAcuity装置を使用するデジタルPCR分析の最適化

miRCURY LNA miRNA PCR Assaysは、高特異性ターゲットの増幅を行うために開発されました。これは、標準リアルタイムサーマルサイクラーを使用するqPCRと、QIAcuity装置およびQIAcuity EG PCR Kitを使用するデジタルPCRの2つのPCR法によって定量できます。miRCURY LNA RT Kitを使用してcDNAを合成後、デジタルPCRにより、非常に正確にターゲットを定量し、最低濃度での最小発現変化さえも検出します。主要なmiRNAのサブセットは、QIAcuity装置で実験的に検証されています。

PCR性能を向上させるLNA

miRCURY LNA miRNA PCR Assaysは、厳密な設計基準とラボで検証済みのアルゴリズムを用いて開発されています。厳格なアッセイ選択プロセスにより、各プライマーセットはこの上ない特異性と効率をもたらし、極めて信頼性が高く正確な結果が得られます。T_m-正規化とLNA強化により、このプライマーは標準DNAプライマーよりも高い結合親和性を示し、アッセイの感度と特異性が劇的に向上します。

ステムループか標準DNAプライマーのいずれかを使用する他のmiRNA PCRシステムに比べ、LNA強化プライマーでは、特にATリッチなmiRNAに対する感度が大幅に向上します。

設計プロセス

miRCURY LNA miRNA Custom PCR Assay設計ツールを使用すると、設計済み製品として入手できないあらゆるmiRNAに対して、高感度かつ特異的なLNA強化PCRプライマーセットを簡単に設計できます。高度なアルゴリズムにより、約3,000のプライマーペア設計を60種類以上の基準に基づいて評価し、miRNAに最適なLNAプライマーセットを数分以内に見つけます。このツールはmiRNA用に設計されていますが、長さ14–27ヌクレオチドの他のsmall RNAにも使用できます。
設計基準は次のとおりです。

• プライマーのLNA分布を変化させることで融解温度を最適化し、高い増幅効率と特異性を確保。
• 効率的なPCR反応のためのセルフハイブリダイゼーションとクロスハイブリダイゼーションのスコアの計算と調整。
• PCR反応におけるプライマー–ダイマー形成の可能性を回避するための調整。
• LNAオリゴヌクレオチド設計に関する当社の膨大な知識に基づく、プライマー内のLNA塩基のインテリジェントな配置。
• miRBase検索により、配列の類似性が高い潜在的miRNAを特定します。これにより、プライマーセットが、設計されたsmall RNAに対して高度に特異的であることが保証されます。

miRNAプロファイリングのためのユニークなシステム

miRCURY LNA miRNA PCR Assaysは、ユニバーサルRTとLNA PCR増幅を組み合わせることにより、microRNA PCR市場に性能と使いやすさの最高の組み合わせを提供します（miRCURY LNA miRNAデジタルPCRシステム概略図を参照）。ユニバーサルRTにより、1つの第1鎖cDNA合成反応を複数のmiRNA real-time PCRアッセイのテンプレートとして使用できます。これにより、貴重なサンプルを節約し、技術的なばらつきを減らし、研究室で費やす時間を節約できます。さらに、フォワードおよびリバースPCR増幅プライマーはいずれもmiRNA特異的であり、LNAに最適化されています。これにより、1）並外れた感度と非常に低いバックグラウンドがもたらされ、非常に低いレベルのmiRNAの正確な定量が可能になり、2）密接に関連するmiRNA配列を識別できる非常に特異的なアッセイが可能になります。

QIAcuity NanoplatesでのdPCR反応の原理については、こちらで説明しています。

正規化のためのリファレンス遺伝子アッセイ

検証済みの5つのリファレンス遺伝子プライマーセットがdPCRに利用可能であり、高品質のデータ正規化と、さまざまなサンプルタイプから信頼できるデータ生成が可能です（下の表を参照）。このようなControl primer setは、さまざまなヒト組織で構成的かつ比較的に安定して発現する内因性の小さなノンコーディングRNAをターゲットにしています（さまざまなヒト組織におけるリファレンス遺伝子の発現レベル図を参照)。コントロールリファレンス遺伝子は、さまざまなmiRNA発現レベルで正確かつ確実に正規化する可能性をもたらします。詳細については、 miRCURY PCRコントロールページを参照してください。

利用可能なリファレンス遺伝子アッセイのリスト

* デジタルPCRでの使用が検証されています。

プレート方式のシンプルで迅速なワークフロー

パーティショニング、サーマルサイクル、イメージングを1つに統合した完全自動化装置が2時間未満で結果を提供します。ナノプレート方式はフロントエンドのサンプル調製の自動化に適しており、手作業時間をさらに短縮できます。
qPCR実験と同様に、サンプル調製では、希釈したサンプルを96ウェルまたは24ウェルナノプレートに移し、マスターミックスとプライマーを添加します。このシステムは、パーティショニング、サーマルサイクル、イメージングを1つに統合した完全自動化装置で、サンプルから結果までのステップを3時間未満で完了させます。Suite Softwareでリモート解析を行うことができ、ターゲット配列の1マイクロリットルあたりのコピー数の濃度や内蔵品質管理オプションも提供されます。

miRCURY LNA miRNA PCR AssaysをQIAcuity Digital PCR Systemと組み合わせると、成熟miRNA定量のためのデジタル PCR解析が可能になります。