AllStars Negative Control siRNA

• 徹底的に検証済みのネガティブコントロール
• 既知の哺乳動物遺伝子との相同性は皆無
• 非特異的な効果は最小限
• miRNA mimic実験に使用可能

AllStars Negative Control siRNAの性能は表に記載の実験により検証しました。

Affymetrix GeneChip アレイ

複数のネガティブコントロールsiRNAのトランスフェクション後、遺伝子発現への非特異的な影響のレベルをテストするためにゲノムワイドな解析を行ないました。HiPerFect Transfection Reagentを用いて異なる由来の複数のネガティブコントロールsiRNAをMCF-7、K562、初代HUVEC細胞にトランスフェクトしました。これらは、Nonsilencing siRNA（哺乳動物遺伝子と相同性がない）、スクランブルsiRNA（遺伝子特異的なsiRNAと同じ塩基組成を持つが配列が異なる）、人工的なレポーター遺伝子を標的にしたsiRNAが含まれています。続いて、Affymetrix GeneChipアレイを用いてヒト全ゲノムの発現プロファイリングを行ないました。AllStars Negative Control siRNAは非特異的に制御される遺伝子数が常に最も少ないことから、ネガティブコントロールに最適です。一方、他のネガティブコントロールsiRNAは重要な細胞内パスウェイに関与する多くの遺伝子を非特異的に抑制しました（図“ 発現への非特異的な影響が低い”）。

生存細胞の核染色

生存細胞の核染色を用いて核サイズを測定しました。サイズ変化は細胞周期障害や増殖阻害を示唆している可能性があります。様々なタイプのネガティブコントロールsiRNAを用いてテストを行ないました。AllStars Negative Control siRNAは、テストしたコントロールsiRNAの中で最高の結果を提供しました。AllStars Negative Control siRNAのトランスフェクションは、トランスフェクトしていない細胞と比較して、核の大きさに変更はありませんでした。一方、他のnegative control siRNA（Control 1）では核が拡大しました（図“ 核サイズの表現型は影響を受けない”）。

細胞数

細胞数は、細胞が正常に増殖していたかどうかを判断するために様々なネガティブコントロールsiRNAのトランスフェクション後に評価しました。未処理の細胞とAllStars Negative Control siRNAをトランスフェクトした細胞では細胞数の違いはほとんど観察されませんでした。一方、その他のテストしたネガティブコントロールsiRNAのトランスフェクション後では細胞数は顕著に減少しており、Control 1のようにこれらのsiRNAが細胞増殖を抑制することを示唆しています（図“ 細胞数に影響を与えないsiRNA”）。

ヌクレオチドの取り込み

トランスフェクトしていないHCT-116細胞と様々なネガティブコントロールsiRNAでトランスフェクトしたHCT-116細胞におけるDNA合成速度を決定するために、ヌクレオチドの取り込みを測定しました。ヌクレオチド取り込みはブロモデオキシウリジン（BrdU）取り込みを調べることにより測定しました。これはチミジンの塩基アナログで、DNA複製時のチミジンの代替として、新たに合成されたDNAに組み込まれます。 DNA合成率の変化は、細胞増殖または細胞周期の変化を示しています。 AllStars Negative Control siRNAをトランスフェクトした細胞のBrdU取り込み率は、トランスフェクトしていない細胞のそれに非常に類似していました。 しかし、テストした他のネガティブコントロールsiRNA（Control 1）では、DNA合成レベルの低いプロファイル変化が得られ、このsiRNAが細胞増殖や細胞周期に影響を与えることを示唆しています（図“ 通常のDNA合成における表現型”）。​​

生存細胞の色素排除

生細胞色素排除は様々なネガティブコントロールsiRNAの潜在的な細胞毒性効果を測定するために使用されていました。 AllStars Negative Control siRNAでトランスフェクトした細胞とトランスフェクトしていない細胞は、生細胞と死細胞の数で類似した結果が得られました。対照的に、他のネガティブコントロールsiRNAでは細胞毒性の増加が観察されました（図“ 細胞毒性効果の増加なし”）。

細胞周期解析のためのDNA染色

細胞周期分布を測定するために細胞固定の後にDNA染色を用いました（細胞周期G1/G0、S、G2）。AllStars Negative Control siRNAのトランスフェクション後、各周期での細胞の比率はトランスフェクトされていない細胞のものと類似しています（図“ 正常の細胞周期分布”）。この結果はAllStars Negative Control siRNAが細胞周期に悪影響を及ぼさないことを証明しています。

RISCへの取り込みを評価するためのレポーター・コンストラクトのトランスフェクション

正確なネガティブコントロールRNAi実験のために、ネガティブコントロールsiRNAはRISC（RNA-Induced Silencing Complex）に組み込まれるべきです。 これは、コントロールsiRNAが遺伝子特異的なsiRNAと同様の生物学的プロセスを通過し、遺伝子特異的なsiRNAからのデータをネガティブコントロールsiRNAからのデータと比較でき、ターゲット遺伝子のノックダウンに起因するという結果を決定できることを意味します。

実験は以下のように行ないました。

全てのRNAi実験でネガティブコントロールsiRNAをトランスフェクトすることが重要です。ネガティブコントロールでの結果を未処理の細胞での結果と比較しなければなりません。遺伝子発現および表現型が未処理の細胞とネガティブコントロールsiRNAをトランスフェクトした細胞において類似していることが理想です。ネガティブコントロールsiRNAをトランスフェクトした細胞で発現あるいは表現型の変化が観察された場合には、これらの変化はトランスフェクション操作あるいはsiRNAの毒性や配列の相補性がないことなどによる非特異的なものです。非特異的な効果は確実なRNAi/miRNA結果を確保するために最小限でなくてはなりません。

ネガティブコントロールでの結果は実験している遺伝子特異的なRNAi/miRNAによる結果と比較することもできます。ネガティブコントロール処理したサンプルはsiRNA/miRNA配列が違うだけで同じ生物学的な過程を経ているため、この両者を比較することにより研究者は標的遺伝子のノックダウンが遺伝子発現や表現型へ効果を及ぼしたかを正確に判断することができます。

AllStars Negative Control siRNAを用いた実験結果は以下のように利用できます：

• 実験設定が非特異的な効果を引き起こしたかどうかを決定するために、トランスフェクトしていない細胞での結果と比較
• 標的遺伝子のノックダウン効果を正確に判定するため、遺伝子特異的なsiRNAでの結果と比較
• miRNA mimic 実験では、ターゲットのダウンレギュレーション効果を特定するために、遺伝子特異的 miRNA mimicsでの結果と比較

• すべてのルーチンRNAi実験
• RNAiの開始実験
• RNAiを利用したハイスループットスクリーニング
• miRNA mimicトランスフェクションを含む実験