miRNeasy Serum/Plasma Kit – microRNA Isolation

miRNeasy Serum/Plasma Kitは最高200 µlの血清あるいは血漿からRNAを精製します。miRNeasy法を用いて調製した RNA は、解析に悪影響を及ぼす塩やフェノールが混入する可能性を最小限に抑え、感度の高いダウンストリームアプリケーションに直ぐに使用できます。

現在miRNA研究で現在最も関心の高い分野の一つとして、血清や血漿サンプルに存在するmiRNAの評価があります。血清や血漿中に比較的安定に存在する細胞外miRNAは、これらmiRNAレベルの変動が、様々な疾病の非侵襲的バイオマーカーとして利用できる可能性があり、関心が高まっています。いくつかのがんでは、血清や血漿から精製したRNAを用いて数種類のmiRNAの発現の変化がみられました。miRNeasy Serum/Plasma Kitを用いて小量の血漿や血清からRNAを精製できます。血清および血漿からのRNAは通常は100ヌクレオチド未満の分子で構成されています。精製したRNAはmiScript PCR Systemと共にバイオマーカーの検索に使用できます。

miRNeasy Serum/Plasma Kitは、フェノール／グアニジンをベースにしたサンプル溶解法とシリカゲルメンブレンによるトータルRNAの精製を組み合わせています。キットに入っているQIAzol Lysis Reagentはフェノールとグアニジンチオシアネートの混合溶液で、組織の溶解を容易にし、RNaseを阻害、また有機溶媒抽出によりほとんどの細胞のDNAとタンパク質をライセートから除去するようにデザインされています。

標準化用インターナルコントロールの使用

血清または血漿サンプル中のmiRNA発現プロファイリングのための標準化用インターナルコントロールとして何を使用すべきかについては、研究者の間においてまだ明確なコンセンサスはありません。多くの研究者が、RNA回収率と逆転写効率をモニタリングするために、RNA精製に合成miRNAを添加する方法を選択しています。QIAGENは血清あるいは血漿中のmiRNA発現プロファイルのインターナルコントロールとして RNeasy Serum/Plasma Spike-In Control（別途注文）を推奨しています。miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Controlは C. elegans miR-39 miRNA mimic であり、miScript PCR SystemとCe_miR-39_1 miScript Primer Assay（miRNeasy Serum/Plasma Kitに付属）を組み合わせたリアルタイムRT-PCRにより容易に検出できます。詳細はmiRNeasy Serum/Plasma Handbookをご覧ください。

血清あるいは血漿サンプルはQIAzol Lysis Reagentで溶解されます。クロロホルムを添加した後、ライセートを遠心操作により水層と有機溶媒層に分離します。RNAは上の水層に、一方DNAは有機溶媒層、タンパク質は下の有機溶媒層か中間層に含まれています。

上の水層を抽出し、約18ヌクレオチド以上のRNA分子をすべて結合する条件にするため、ライセートにエタノールを添加します。サンプルをRNeasy MinElute Spin Columnにアプライすると、トータルRNA はメンブレンに結合し、フェノールおよびその他の夾雑物は効率的に除去されます。高品質なRNAを少量のRNaseフリー水で溶出します。

血清および血漿は主にsmall RNAを含むので、small RNAとlarge RNA画分の精製を別々に行なう必要はありません。

miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Controlを用いた標準化

miRNeasy Serum/Plasma Kitを使用したmiRNA精製の際に、QIAzol Lysis Reagentの添加後、クロロホルムを加えて液層分離を行なう前に、miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Controlをサンプルに添加します。リアルタイムRT-PCRの後、合成miRNAをターゲットとするアッセイを用いて得られたC_T値によるサンプルの間の標準化と、RNA回収率および増幅効率の変動を確認できます。また、RNAの回収率は、RNA分離手順とは独立して用意された合成miRNAの標準曲線とC_T 値の比較によって評価することができます。

QIAcube上でmiRNA自動精製

層分離後の水層からのmiRNAを含むトータルRNA精製はQIAcubeを用いて自動精製が可能です。革新的なQIAcubeはQIAGENスピンカラムを操作するための最先端テクノロジーを駆使しており、ロースループットサンプルの自動調製をラボにおける様々な実験操作ステップでスムーズに取り込むことができます。QIAcube を用いたサンプル調製はマニュアル操作と同じプロセス（溶解、結合、洗浄、溶出）で行なわれるため、高品質RNAの精製にお手持ちのmiRNeasy Serum/Plasma Kit を使用することができます。

miRNeasy Serum/Plasma Kitは以下のような様々なアプリケーションに使用可能な、miRNAを含む無細胞性のトータルRNA精製を実現します。