HiSpeed Plasmid Mega EF Kit et Giga EF Kit

• Temps de préparation d’environ 50 minutes
• Nettoyage des lysats et précipitation à l’isopropanol sans centrifugation
• Aucun risque de perte de culot d’ADN lors de la précipitation
• Rendement de 10 mg maximum d’ADN plasmidique à nombre de copies élevé
• LyseBlue pour lyse optimale et rendement d’ADN maximal
• Élimination des endotoxines incluse (< 0,04 EU/µg d’ADN)

Les HiSpeed Plasmid Mega EF Kit et Giga EF Kit fournissent une préparation d’ADN plasmidique sous vide, à grande échelle et par échange d’anions, et ne nécessitent qu’une seule étape de centrifugation pour éluer l’ADN plasmidique final. L’ADN purifié équivaut à celui obtenu par une double centrifugation en gradient de CsCl et est adapté aux applications de qualité de transfection. Un collecteur sous vide QIAvac HiSpeed LS est requis pour le protocole.

Les HiSpeed EF Mega Kit et Giga Kit doivent être utilisés conjointement avec le QIAvac HiSpeed LS.

Les HiSpeed Plasmid Mega EF Kit et Giga EF Kit contiennent des QIAfilter Cartridges, des HiSpeed Tips et des modules QIAconcentrator pour une préparation rapide et à grande échelle de plasmide avec un collecteur de vide. Le module QIAfilter sous vide remplace l’étape de centrifugation dans la procédure classique d’échange d’anions, accélérant ainsi la purification et améliorant sa praticité. Le QIAconcentrator produit un ADN hautement concentré par centrifugation après la préparation à l’éthanol. Une quantité maximale de 2,5 mg (Mega) ou 10 mg (Giga) d’ADN plasmidique à nombre de copies élevé peut être purifiée à partir d’une culture de respectivement 500 ml ou 2,5 l (les volumes de culture dépendent du nombre de copies plasmidiques, de la taille de l’insert, de la souche hôte et du milieu de culture). La conception du HiSpeed Tip permet un débit très élevé, ce qui accélère les étapes de liaison, de lavage et d’élution de l’ADN pour la purification de plasmides. L’ADN plasmidique dérivé du HiSpeed ne contient pas d’endotoxines (< 0,04 EU/µg d’ADN).

La résine échangeuse d’anions unique des HiSpeed Tips est élaborée exclusivement pour la purification des acides nucléiques. Ses propriétés de séparation exceptionnelles produisent un ADN dont la pureté est égale ou supérieure à celui obtenu par deux cycles successifs de centrifugation en gradient de CsCl. Les HiSpeed Plasmid Mega EF Kit et Giga EF Kit éliminent les endotoxines bactériennes libérées lors de l’étape de lyse et influencent la transfection de l’ADN dans les cellules primaires et dans les cellules de culture sensibles. L’ADN sans endotoxine obtenu à partir des HiSpeed Plasmid Mega/Giga Kits convient parfaitement aux résultats reproductibles et fiables de transfection. L’ADN ultrapur et sans endotoxine QIAGEN convient également à la recherche en thérapie génique et à d’autres applications sensibles.

Les QIAfilter Cartridges (voir la figure «  QIAfilter Mega-Giga Cartridge ») sont des unités de filtre spéciales conçues pour remplacer l’étape de centrifugation après la lyse alcaline des cellules bactériennes. Les QIAfilter Cartridges éliminent complètement les précipités du SDS et nettoient les lysats bactériens en une fraction du temps nécessaire à la centrifugation. Les HiSpeed Tips préemballés fonctionnent par écoulement par gravité et ne s’assèchent jamais, ce qui réduit le temps de manipulation nécessaire à la préparation des plasmides.

Le QIAconcentrator unique (voir la figure «  Procédure HighSpeed Plasmid Giga EF ») remplace l’étape de centrifugation traditionnellement utilisée pour prélever l’ADN précipité dans l’isopropanol après la purification. Le module QIAconcentrator capture l’ADN précipité tandis que le mélange d’isopropanol et de tampon passe à travers. L’ADN est ensuite simplement élué à partir du QIAprecipitator dans un tube de prélèvement contenant un tampon TE ou de l’eau. Ce module unique élimine également le risque de perte du culot, qui peut survenir lors du décantage du surnageant après la précipitation.

Les endotoxines, aussi connues sous le nom de lipopolysaccharides ou LPS, sont des composants de la membrane cellulaire des bactéries à Gram négatif telles qu’E. coli (voir la figure «  Paroi cellulaire bactérienne »). Les endotoxines sont libérées au cours de l’étape de lyse de la purification des plasmides et réduisent nettement les efficacités de transfection dans les lignées cellulaires sensibles des endotoxines. De plus, les endotoxines peuvent influencer l’introduction d’ADN plasmidique dans les expériences de transfection en tant que réactif de transfection « libre », rivalisant ainsi avec l’ADN.

Les endotoxines induisent également l’activation non spécifique des réponses immunitaires dans les cellules immunitaires telles que les macrophages et les lymphocytes B, ce qui peut conduire à une interprétation erronée des résultats de transfection. Ces réponses comprennent la synthèse induite des protéines et des lipides, tels que l’IL-1 et la prostaglandine. Dans l’ensemble, les endotoxines représentent une variable non contrôlable de la configuration de l’expérience de transfection, influençant l’issue et la reproductibilité des résultats et rendant leur comparaison et leur interprétation difficiles. Dans la recherche en thérapie génique, les endotoxines peuvent interférer en provoquant le syndrome de choc endotoxique et l’activation en cascade du système du complément. >

Les lysats bactériens neutralisés sont incubés dans la QIAfilter Cartridge et sont nettoyés en quelques secondes sous vide. À ce stade, l’Endotoxin Removal Buffer est ajouté au lysat filtré. Aucune incubation n’est nécessaire. Le filtrat est appliqué à un HiSpeed tip pour la purification d’ADN plasmidique (voir la figure «  Procédure HighSpeed Plasmid Giga EF »). L’ADN élué est mélangé avec de l’isopropanol et appliqué au QIAconcentrator sous vide, puis lavé. L’ADN concentré et dessalé est ensuite élué à partir du QIAconcentrator directement dans un tube de prélèvement frais contenant un tampon TE ou de l’eau.

L’ADN purifié grâce aux HiSpeed Plasmid Mega EF Kit et Giga EF Kit produit d’excellents résultats dans toutes les applications, du clonage et du séquençage à la transfection de cellules très sensibles et de cellules primaires et à l’inactivation génique à médiation plasmidique.