Verogen ForenSeq MainstAY Kit

• La mayor combinación de STR establecidos en una sola amplificación
• Cumple los requisitos mínimos para haplotipos de cromosoma Y de SWGDAM, CODIS, Interpol y ESS
• Perfiles completos a partir de bajas entradas de ADNg
• Detección de alelos a partir de muestras complicadas con un balance superior y altas tasas de resultados
• Secuenciación simultánea de 96 muestras por corrida
• Aprobado para su carga en el sistema nacional de índices de ADN (National DNA Index System, NDIS) para muestras de casos (sin secuenciación [SE])

Centre su análisis en los STR autosómicos básicos y de cromosoma Y con la línea de productos ForenSeq MainstAY, la forma más accesible de generar datos muy discriminatorios para casos convencionales y pruebas confirmatorias de genealogía genética forense. Elija entre dos opciones geográficamente relevantes: el ForenSeq MainstAY Kit aprobado por el NDIS, diseñado específicamente para admitir la mayoría de cargas de STR en bases de datos nacionales, y el ForenSeq MainstAY SE kit, que incluye el marcador SE33 altamente polimórfico. Al centrarse en los STR establecidos que se emplean en las aplicaciones rutinarias de identificación humana y conservar la compatibilidad con bases de datos globales, los productos MainstAY facilitan la transición a la secuenciación de última generación. El conocido flujo de trabajo de ForenSeq, de eficacia comprobada, genera más perfiles de ADN completos para hasta 96 muestras de evidencias y menos de 2 horas de tiempo de intervención.

ForenSeq MainstAY ofrece un punto de transición sencillo para incluir la secuenciación de última generación (NGS) en su flujo de trabajo operativo. La NGS admite la tipificación simultánea de diversas categorías de STR en una sola reacción. Esto permite recuperar la mayor cantidad de información posible a partir de una muestra forense. La NGS también combina el poder discriminatorio de los STR con variaciones a nivel de secuencia adicionales, lo que puede resolver los isoalelos de un STR. El Kit ForenSeq MainstAY contiene reactivos para amplificar 27 locus autosómicos y 25 locus de STR de cromosoma Y como amplicones pequeños, así como para generar datos de secuenciación en el MiSeq FGx Sequencing System empleando el MiSeq FGx Reagent Micro Kit. Con este flujo de trabajo, el polimorfismo de longitud de secuencias y alelos en los STR autosómicos y los STR de cromosoma Y se puede identificar con una sola amplificación. Esto elimina la necesidad de realizar varios flujos de trabajo. Además, aumenta al máximo el valor informativo de una muestra forense, incrementando así el poder de inclusión estadístico. La NGS también termina con el problema del solapamiento de alelos, lo que permite a los usuarios explorar más alelos en la reacción múltiple.

• La combinación de locus de STR y amelogenina es una herramienta efectiva para la identificación humana
• Mantiene la compatibilidad con bases de datos actuales de todo el mundo
• Las recomendaciones de entrada baja de 1 ng de ADN posibilitan una alta tasa de resultados reproducible
• Analice datos de secuencias en una interfaz familiar y de fácil uso con el MainstAY Analysis Module
• Genere informes en menos de 1.5 días

La inclusión de 27 STR autosómicos, 25 STR de cromosoma Y y amelogenina en una sola reacción proporciona una razón de verosimilitud esperada mayor que la mayoría de los kits de STR autosómico del mercado. Además, permite realizar comparaciones directas de perfiles de origen único (p. ej., con búsquedas en bases de datos y uso compartido de datos internacionales), independientemente del ensayo que se utilice para clasificar la muestra comparativa. El perfil genético que genera ForenSeq MainstAY permite realizar búsquedas de casos con STR autosómicos, así como búsquedas de haplotipos con una base de datos de STR de cromosoma Y. Los STR de cromosoma Y producen un perfil de haplotipo a partir de ADN masculino. Esto resulta extremadamente útil al trabajar con mezclas de muestras masculinas y femeninas. En presencia de un solo contribuyente masculino, se puede utilizar para excluir a posibles factores contribuyentes masculinos.

El número máximo de genotecas que se pueden secuenciar a la vez depende del número de lecturas o de la profundidad de cobertura (depth of coverage, DoC) que se desee por locus. El equilibrio en la cobertura de las lecturas en los amplicones también es fundamental para la recuperación de locus y alelos. El ForenSeq MainstAY Kit incluye un pequeño número de marcadores multiplexados en una sola reacción de secuenciación, lo que da lugar a una gran cobertura total. El equilibrio entre locus se determinó empleando genotecas MainstAY a partir de 1 ng de ADN de entrada de 46 muestras masculinas del Coriell, incluido un control de amplificación positivo, 49 muestras femeninas del Coriell y un NTC. La cobertura media en los STR autosómicos y STR de cromosoma Y con muestras masculinas fue de 669 y 469 lecturas, respectivamente. La cobertura media de los STR autosómicos con muestras femeninas fue de 1065 lecturas. La diferencia entre los STR autosómicos con profundidad de cobertura máxima y mínima fue de 15 veces, mientras que la diferencia entre los STR de cromosoma Y con lecturas máximas y mínimas fue de 46 veces (consulte la figura “Profundidad de cobertura media para los marcadores incluidos en el ForenSeq MainstAY Kit”). La mediana del equilibrio entre locus para muestras masculinas, expresada en porcentaje de lecturas totales, fue del 1,9 % (STR autosómicos: 2,2 % y STR de cromosoma Y: 1,6 %). Con muestras femeninas, el equilibrio entre locus para los STR autosómicos fue del 3,7 % (consulte la figura “Equilibrio entre locus para marcadores genéticos incluidos en el ForenSeq MainstAY Kit”).

El equilibrio dentro de los locus (intralocus balance, ILB) o el equilibrio heterocigótico (heterozygous balance, HB) se calculó como relación del número más bajo de lecturas de alelos con el número más alto de lecturas de alelos para un par heterocigótico. En comparación con los STR basados en EC, la NGS muestra un mayor alcance para el ILB debido a los sesgos de amplificación con amplicones más pequeños durante la preparación y secuenciación de genotecas. El ILB para pares genotípicos heterocigóticos e isométricos se evaluó empleando muestras de 1 ng de ADN en este estudio para cada muestra y locus. Todos los marcadores del panel mostraron valores de ILB superiores al 60 %, con una mediana de ILB del 86 %. La cobertura y la baja variación del ForenSeq MainstAY Kit indica que los amplicones están bien equilibrados. Esto reduce la probabilidad de pérdida de locus o alelos, y mejora la identificación de factores contribuyentes menores en una mezcla (consulte la figura ”Equilibrio dentro de los locus para marcadores genéticos incluidos en el ForenSeq MainstAY Kit con una entrada de ADN de 1 ng”).

La capacidad de generar genotipos y haplotipos en diversas entradas se evaluó con ADNg diluido en serie en cantidades de molde de 1 ng, 500 pg, 250 pg, 125 pg, 62,5 pg, 31,25 pg, 15,625 pg y 7,82 pg, por triplicado. Se secuenciaron 96 genotecas simultáneamente con el MiSeq FGx Reagent Micro Kit. El ForenSeq MainstAY Kit ofrece un gran nivel de sensibilidad; genera perfiles completos (sin pérdida de alelos) y una tasa de resultados del 100 % con tan solo 62,5 pg de ADN de entrada al secuenciar 96 genotecas simultáneamente. Para determinar la tasa de resultados de alelos y la exactitud comparativa de los datos genotípicos de secuenciación, los genotipos y los haplotipos se generaron con el MainstAY Analysis Module en Universal Analysis Software; para ello, se usaron los ajustes predeterminados y se compararon con los datos de genotipado ortogonales de métodos de genotipado convencionales (detección de la longitud de los fragmentos de EC para STR). Los STR autosómicos mostraron una concordancia del 100 % hasta 62,5 pg, con una concordancia del 95 % incluso a 31 pg. Los STR de cromosoma Y mostraron una concordancia del 100 % hasta 125 pg, con una concordancia del 91 % con incluso hasta 31 pg. Todos los resultados no concordantes se debieron a un tartamudeo que superó el filtro de tartamudeo predeterminado establecido para muestras de 1 ng. (Consulte la figura “Estudio de sensibilidad con muestras de ADNg diluido en serie y amplificadas por triplicado”).

Para evaluar la concordancia de los genotipos y los haplotipos generados por el ForenSeq MainstAY Kit, se prepararon y secuenciaron por triplicado 31 genotecas que incluían las normas 2391d del SRM del NIST, ADN del Coriell, un control de amplificación positivo y tres NTC. Los datos se analizaron con el MainstAY Analysis Module en Universal Analysis Software con umbrales de análisis y filtros de tartamudeo predeterminados. La exactitud de los genotipos y los alelos de haplotipos se determinó mediante la comparación con los datos de EC ortogonales. La precisión y las tasas de resultados se determinaron mediante experimentos de repetibilidad y reproducibilidad, en los que tres operadores prepararon y secuenciaron genotecas de 15 muestras de ADN de control por cuadruplicado con un control de amplificación positivo y tres NTC en tres instrumentos MiSeq FGx distintos. Se observó una exactitud alta en los STR autosómicos (99,82 %) y los STR de cromosoma Y (100 %). Se detectaron seis alelos discordantes de los 3261 alelos de STR autosómicos. No se detectaron alelos discordantes en los 774 alelos de STR de cromosoma Y. De forma similar, se observaron tasas de precisión altas del 99,87 % y del 99,42 % en los STR autosómicos y los STR de cromosoma Y, respectivamente. Todas las discrepancias se atribuyeron a alelos de tartamudeo que superaban los filtros de tartamudeo predeterminados.

Para evaluar la capacidad del ForenSeq MainstAY Kit de detectar alelos menores en factores contribuyentes de nivel bajo, se generaron mezclas de muestras de control femeninas y masculinas a 1 ng, siendo la muestra femenina el factor contribuyente más importante. El porcentaje del factor contribuyente menor de la mezcla fue de entre un 50 y un 0,2 %. El número de alelos menores contribuyentes y únicos no compartidos de la mezcla se determinó mediante los umbrales analíticos e interpretativos predeterminados, así como filtros de tartamudeo en el MainstAY Analysis Module en Universal Analysis Software (consulte la figura “Mezclas de muestras de control de ADNg femeninas:masculinas con niveles diluidos en serie del factor contribuyente menor”). Con el 50 % del factor contribuyente menor, se detectaron 31 alelos autosómicos menores únicos y 27 alelos del cromosoma Y. Se pudieron detectar aproximadamente 15 alelos autosómicos menores únicos (50 % de alelos de STR autosómicos únicos) y 26 alelos del cromosoma Y con una contribución del 5 % menor. Con una contribución del 1 % menor, se pudieron detectar más de 10 locus de STR de cromosoma Y. ForenSeq MainstAY permite una identificación eficiente de factores contribuyentes menores en una mezcla, incluso con contribuciones de nivel bajo.

Se evaluó la capacidad de clasificar genotipos y haplotipos de muestras de ADN degradado con el flujo de trabajo de ForenSeq MainstAY empleando ADNg parcialmente degradado que simula muestras forenses expuestas a agresiones ambientales y químicas. Se prepararon y secuenciaron por triplicado genotecas a partir de 1 ng de sangre degradada de 30 muestras, 1 control de amplificación positivo y NTC utilizando el Miseq FGx Reagent Micro Kit. Se usó el índice de degradación (degradation index, DI) para evaluar la calidad de las muestras de las genotecas. Las muestras con un DI de 1–4 se consideraron no degradadas, las muestras con un DI de 4–10 se consideraron moderadamente degradadas y aquellas con un DI >10 se consideraron considerablemente degradadas. Las muestras analizadas con MainstAY tuvieron un DI de entre 1 y 56, abarcando muestras con degradación baja, moderada y alta. Todos los STR se clasificaron con exactitud en muestras sin degradación. Las muestras con degradación moderada mostraron una tasa de resultados >85 % de los STR tipificados con exactitud, mientras que las muestras considerablemente degradadas tuvieron una tasa de resultados >71 %, lo que indica una pérdida mínima de STR amplificables. La muestra con el DI más alto de 56 mostró una recuperación de alelos del 60 % (40 de 74). ForenSeq MainstAY permite la detección de un alto número de alelos, incluso con muestras considerablemente degradadas (consulte la figura “ADN genómico extraído de muestras de sangre degradadas”).

El flujo de trabajo de ForenSeq MainstAY se basa en la química de ForenSeq conocida que respalda la gama de productos de preparación de genotecas de Verogen. Este ensayo de PCR sensible amplifica de forma eficiente 53 marcadores con índices dobles únicos (Unique Dual Indices, UDI), generando amplicones cortos que aumentan la probabilidad de detectar alelos en ADN degradado. El volumen de entrada de extracción de ADN, de 8 μl, promueve la flexibilidad con muestras de concentración baja y la dilución de muestras inhibidas.

Esta solución totalmente equipada incluye un control de amplificación positivo, el cual permite adquisiciones y calibraciones sencillas. El kit permite la secuenciación y el análisis de hasta 96 muestras en el MiSeq FGx Reagent Micro Kit empleando la capacidad de lectura de extremo pareado largo del MiSeq FGx Sequencing System, lo que aumenta al máximo el rendimiento de las muestras y reduce al mínimo el coste por muestra. La recomendación de una entrada de ADNg baja de 1 ng permite la recuperación fiable y reproducible de perfiles completos a partir de muestras de alta calidad y origen único, hasta una entrada baja de 62,5 pg y muestras complicadas.

El ForenSeq MainstAY Kit permite un flujo de trabajo de principio a fin en menos de 30 horas cuando se usa junto con el MiSeq FGx Sequencing System, el MiSeq FGx Reagent Micro Kit y el MainstAY Analysis Module en Universal Analysis Software (UAS). El MainstAY Analysis Module proporciona una exploración guiada, una visualización detallada con vistas de proyectos y muestras, y revisiones meticulosas de resultados de alelos de STR con amplias capacidades de filtrado y clasificación. También genera informes legibles que se pueden exportar en varios formatos. Este flujo de trabajo integrado proporciona un punto de entrada rentable a los laboratorios que están considerando la NGS para aplicaciones forenses.

El flujo de trabajo incluye cinco puntos de paro seguros y una placa de adaptadores previamente mezclados que aumenta la eficiencia y la facilidad de la preparación de genotecas. El flujo de trabajo es compatible con diversas fuentes comunes de ADN forense, como el ADNg extraído, lisados sin procesar y punciones de tarjetas de medios de almacenamiento, como FTA.

• Análisis centrado y eficiente para casos de gran volumen

Explore de forma simultánea el mayor conjunto de loci bien caracterizados, incluidos 27 marcadores STR autosómicos y 25 marcadores de cromosoma Y para un máximo de 96 muestras. Genere perfiles equilibrados compatibles con todas las bases de datos de STR existentes a partir de tan solo 100 pg. Analice datos de forma eficiente con un módulo de análisis de interacción mínima; elija entre una variedad de opciones de exportación listas para la carga que son compatibles con los requisitos de bases de datos regionales.

• Mejores datos, costo similar

Obtenga datos muy discriminatorios para loci de STR centrales del CODIS y del conjunto de normas europeas (European Standard Set, ESS) en una sola amplificación y una serie de secuenciación con un coste similar al de los análisis de EC tradicionales. Libere el poder de la secuenciación de última generación, sean cuales sean sus requisitos de rendimiento con una selección de dos tamaños de kit de secuenciación.

• Totalmente integrado y compatible

El flujo de trabajo completo se basa en el proceso establecido de ForenSeq, lo que permite una amplia variedad de análisis de ADN en una única plataforma de eficacia demostrada. El ForenSeq MainstAY Kit se vincula a la perfección con el UAS, con el fin de evaluar los datos con rapidez y de generar informes con un solo clic.

El MainstAY Analysis Module en el Universal Analysis Software (UAS) permite evaluar datos de secuenciación mediante el uso de puntuaciones de calidad conocidas, umbrales y orientación. La solución incluye ajustes de análisis predeterminados que el laboratorio puede modificar según necesite. Además, este módulo se ha diseñado para aumentar la eficiencia operativa de los laboratorios forenses de gran volumen, con vistas generales optimizadas de proyectos y muestras que facilitan la revisión de marcadores con indicadores de control de calidad. Sus nuevas capacidades de clasificación y filtrado permiten a los usuarios categorizar y evaluar un subconjunto de STR empleando diversos indicadores de control de calidad. La sencillez de los análisis de secuencias de alelos de STR de poblaciones con alelos mezclados, como los heterocigotos isométricos, es posible gracias a la capacidad de desplazarse fácilmente entre ambos resultados de alelos y la información de niveles de secuencia.

Ofrecemos una asistencia superior en todo el flujo de trabajo, desde la preparación de bibliotecas hasta la secuenciación y el análisis. Nuestro experimentado equipo ofrece cobertura de servicio total para su equipo y su software, planes de validación y orientación para implementaciones. De este modo, puede poner en práctica sus flujos de trabajo con facilidad.