Aplicaciones de las PCR digitales

Detección de mutaciones poco frecuentes

La detección de mutaciones poco frecuentes (rare mutatio detection, RMD) hace referencia a la detección de variantes de secuenciación que están presentes en cantidades bajas en un grupo de moléculas nativas de fondo (menos de 1 % o incluso 0,1 %). Por ello, para detectar y cuantificar eventos poco frecuentes, como mutaciones puntuales o polimorfismos de un solo nucleótido (single nucleotide polymorphisms, SNP), se requiere un método sensible, preciso y exacto. El reto principal es diferenciar entre dos secuencias muy similares, una de las cuales es mucho más abundante que la otra.

Un ejemplo de una mutación poco frecuente sería detectar una mutación de un solo nucleótido de baja frecuencia en una muestra de biopsia de cáncer.

Análisis de variación en el número de copias 

Los análisis de variación en el número de copias (CNV) determinan el número de copias de un gen en concreto en el genoma de un individuo. Se sabe que los genes se dan en dos copias por genoma. Sin embargo, estos genes pueden aparecer en una frecuencia mayor, en algunos casos. La amplificación genética (que activa los oncogenes) y la eliminación (que desactiva los genes supresores de tumores) son alteraciones del número de copias (CNA) importantes que afectan a los genes relacionados con el cáncer, además de los cambios genómicos como las mutaciones, las translocaciones y las inversiones. La mayor parte de los genes relacionados con el cáncer y a los que les afectan las CNA se han definido como genes esenciales de las vías de detección del cáncer que tienen que ver con la carcinogénesis y el avance de la enfermedad. Las CNV son una fuente fundamental de diversidad genética (deleción o duplicación de un locus) y posibilitan el estudio de los genes asociado a las enfermedades autoinmunitarias y neurológicas más frecuentes, los trastornos genéricos y las respuestas adversas a ciertos fármacos.

Análisis de expresión genética

La caracterización de expresiones genéticas compara de manera simultánea los niveles de expresión de varios genes entre dos o más muestras. Gracias a estos análisis, los científicos pueden definir la base molecular de las diferencias fenotípicas y seleccionar los elementos diana genéticos para estudios en profundidad. La caracterización de expresiones genéticas proporciona una información muy valiosa en la función de expresión genética diferencial en enfermedades y estados biológicos normales.

Análisis de expresión de miARN

La caracterización de expresiones de microRNA (miRNA) compara de manera simultánea los niveles de expresión de varios miARN o miARN únicos entre dos o más muestras. Gracias a estos análisis, los científicos pueden identificar y cuantificar el miARN como biomarcador en enfermedades agudas, como el cáncer. Proporciona información muy valiosa sobre la función de la expresión de miARN en las enfermedades y los estados biológicos normales.

Detección de microrganismos patógenos microbianos

La combinación de velocidad, alta sensibilidad, precisión y cuantificación absoluta es esencial para la detección de microrganismos patógenos y el análisis de microbiomas en el sector de la salud pública y la epidemiología. Es fundamental para llevar a cabo estudios filogénicos para la identificación, detección, caracterización y monitorización de cambios en patógenos y microbiomas. El área de aplicación es amplia y abarca microrganismos patógenos en los alimentos, resistencia a los fármacos, investigación de microrganismos, etc. En la detección de microrganismos patógenos, los patógenos microbianos se detectan de forma simultánea con virus, como en la relación virus/bacteria-anfitrión.

Cuantificación de carga vírica

Las pruebas de carga vírica miden la cantidad de un virus específico en una muestra biológica. Los resultados se indican como el número de copias del ARN vírico por mililitro de muestra. Las pruebas de carga vírica se utilizan para diagnosticar infecciones víricas agudas, proporcionar orientación en la elección de tratamientos y supervisar la respuesta a los tratamientos médicos.

Biopsia líquida

Una biopsia líquida, también conocida como biopsia de fluidos o biopsia en fase de fluidos, es el muestreo y análisis de un tejido biológico que no es sólido (por lo general, sangre). Se utiliza fundamentalmente como herramienta de diagnóstico y supervisión de enfermedades como el cáncer. La biopsia líquida es menos invasiva para el donante en comparación con la biopsia de tejidos. Cuando las células tumorales mueren, liberan ctDNA a la sangre. Las mutaciones del cáncer en el ctDNA reflejan las que se detectan en las biopsias tumorales tradicionales, por lo que pueden emplearse como biomarcadores para llevar a cabo un seguimiento de la enfermedad. El mayor problema se debe a la baja concentración de ctDNA de las células tumorales de la sangre. El método de referencia ha sido usar la NGS, la pirosecuenciación o las real-time qPCR, pero el gran problema de estos métodos es su limitación en cuanto al límite de detección. La pirosecuenciación de tejido tumoral de alrededor del 10 %, la NGS se encuentra entre 1–5 % y las qPCR pueden detectar cantidades de un 1 %. Esto supone un problema para el relapso durante la monitorización de enfermedades residuales en el donante, por las limitaciones en los niveles de detección.

Detección de GMO 

Los organismos genéticamente modificados (genetically modified organism, GMO) hacen referencia habitualmente a los cultivos con alteraciones genéticas. La ingeniería genética proporciona la tecnología necesaria para introducir ciertos rasgos deseados, como la resistencia a los virus o insectos, un mayor rendimiento, una composición mejorada, etc. La detección de GMO puede ser cualitativa (presencia) o cuantitativa (cantidad de GMO). Además, puede ser específica de cada evento, es decir, que detecta la presencia de una secuencia de ADN única del GMO específico, o específica de cada preparado, esto es, que detecta la secuencia de ADN extraña insertada en un GMO. Las pruebas de detección de GMO son esenciales para ayudar a que las personas que trabajan en la producción, exportación o importación de cultivos cumplan con los criterios normativos. Las real-time PCR, que son el método más recurrente en la actualidad, están limitadas a la detección y cuantificación de moléculas de ADN diana en baja cantidad, que a menudo se ven en matrices de alimentos complejos. 

Detección de ediciones genómicas (CRISPR-Cas9)

En los estudios de edición genómica, las nucleasas como las proteínas con dedos de zinc (ZFN), los efectores TALEN (nucleasa de actividad similar a activador de transcripción) y las repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas de forma regular y agrupadas (CRISPR) se utilizan para editar los genomas de cualquier célula. Estas nucleasas producen roturas de doble cadena (double-strand breaks, DSB) en el ADN específico del sitio, que se pueden reparar mediante recombinaciones no homólogas con tendencia a error (NHEJ) (mutación de punto preciso/modelo de donante) o mediante rutas de reparación dirigida por homología (homology-directed repair, HDR) (deleción/inDel/inserción) que generan una mutagénesis dirigida. Como resultado, se desarrolla una población mezclada de células con errores de inDel heterogéneos y frecuencias de edición de alelos variantes. Después, se miden las frecuencias de edición de genomas en el punto deseado. Las estirpes de células clonales aíslan las células únicas, que se someten a un ensayo para comprobar el evento de edición del genoma.

Validación y cuantificación de genoteca de NGS

Hoy en día, los procesos de validación y cuantificación de la genoteca de NGS se llevan a cabo mediante distintos métodos. El uso de los sistemas espectofotométricos y fluorométricos y las qPCR está limitado en cuanto a la cuantificación precisa de genotecas generadas. Contar con una concentración precisa de genotecas es fundamental para un procesamiento de secuenciación rentable y exacto. La metodología de las real-time PCR ha sido, hasta el momento, la solución preferente para la validación de las ejecuciones de secuenciación. El mayor inconveniente es la falta de precisión cuando necesita validar detecciones en su NGS por debajo del 1 %. 

Cuantificación de ADN de células de anfitrión residuales

El proceso de cuantificación de ADN de células de anfitrión residuales se lleva a cabo durante los procesos de fabricación de vacunas y proteínas terapéuticas. Los niveles aceptables se determinan según las agencias regulatorias, como la Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU. y la Organización Mundial de la Salud. Los kits de cuantificación de ADN residual digitales son perfectos para la cuantificación de alta precisión de HCD en bioprocesos complejos.  Algunas de estas células que pasan por un proceso de eliminación durante el desarrollo de terapias genéticas, vacunas basadas en células y bioterapias similares, etc., son, por ejemplo, HEK293, CHO o E. coli.

Publicaciones

Consulte esta amplia lista de artículos en los que se tratan las distintas aplicaciones que utilizan la tecnología de QIAGEN Nanoplate dPCR .

• Boogaerts T et al. (2021). An alternative approach for bioanalytical assay optimization for wastewater-based epidemiology of SARS-CoV-2. Science of The Total Environment, Volume 789, Article 148043.
• Luo Y et al. (2020). Massively parallel single-molecule telomere length measurement with digital real-time PCR. Sci Adv. 6(34):eabb7944.
• Lee EG et al. (2021). TOMM40 RNA Transcription in Alzheimer’s Disease Brain and Its Implication in Mitochondrial Dysfunction. Genes. 12, 871.
• Wirtz RM et al. (2021). FGFR testing from matched tissue and urine samples within the prospective real world clinico-pathological register trial BRIDGister. Journal of Clinical Oncology. 39:15_suppl, e16532-e16532.
• [Solo versión de preimpresión] Yang JX et al. (2021). Digital PCR quantification of DNA, RNA and extracellular microRNA of mouse oocytes.
• Ferasin L et al. (2021). Infection with SARS-CoV-2 variant B.1.1.7 detected in a group of dogs and cats with suspected myocarditis. Vet Rec. 2021 Nov;189(9):e944.
• [Solo versión de preimpresión] Wu X et al. (2021). A Warm-start Digital CRISPR-based Method for the Quantitative Detection of Nucleic Acids.
• [Solo versión de preimpresión] Viveros ML et al. (2021). Wild Type and Variants of Sars-Cov-2 in Parisian Sewage: Dynamics in Raw Water and Fate in Wastewater Treatment Plants.
• Romanelli K et al. (2021) Clinical and molecular characterization of thyroid cancer when seen as a second malignant neoplasm. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism. Volume: 12
• Murphy LA et al. (2021) Detection of Vector Copy Number in Bicistronic CD19xCD22 CAR T Cell Products with Digital PCR. Blood. 138 (Supplement 1): 4001.
• [Solo versión de preimpresión] Toffoli M et al. (2021) Comprehensive analysis of GBA using a novel algorithm for Illumina whole-genome sequence data or targeted Nanopore sequencing.
• Passera A et al. (2021) Bacterial Communities in the Embryo of Maize Landraces: Relation with Susceptibility to Fusarium Ear Rot. Microorganisms, 9(11), 2388.