Aplicaciones de las PCR digitales

Detección de mutaciones raras

La detección de mutaciones raras (rare mutatio detection, RMD) hace referencia a la detección de variantes de secuenciación que están presentes en cantidades bajas en un grupo de moléculas nativas de fondo (menos de 1 % o incluso 0,1 %). Por ello, para detectar y cuantificar eventos poco frecuentes, como mutaciones puntuales o polimorfismos de un solo nucleótido (single nucleotide polymorphisms, SNP), se requiere un método sensible, preciso y exacto. El reto principal es diferenciar entre dos secuencias muy similares, una de las cuales es mucho más abundante que la otra.

Un ejemplo de detección de mutación rara sería la detección de una mutación de un solo nucleótido de baja frecuencia en una muestra de biopsia de cáncer.

Análisis de variación en el número de copias 

Los análisis de variación en el número de copias (CNV) determinan el número de copias de un gen en concreto en el genoma de un individuo. Se sabe que los genes se dan en dos copias por genoma. Sin embargo, estos genes pueden aparecer en una frecuencia mayor, en algunos casos. La amplificación genica (que activa los oncogenes) y la eliminación (que desactiva los genes supresores de tumores) son alteraciones del número de copias (CNAs) importantes que afectan a los genes relacionados con el cáncer, además de los cambios genómicos como las mutaciones, translocaciones e inversiones. La mayor parte de los genes relacionados con el cáncer y a los que les afectan las CNA se han definido como genes críticos de las vías de detección del cáncer que tienen que ver con la carcinogénesis y el avance de la enfermedad. Las CNV son una fuente fundamental de diversidad genética (eliminación o duplicación de un locus) y posibilitan el estudio de los genes asociado a las enfermedades autoinmunitarias y neurológicas más frecuentes, los trastornos genéticos y las respuestas adversas a fármacos.

Análisis de expresión genética

El perfil de expresión génica compara de manera simultánea los niveles de expresión de varios genes entre dos o más muestras. Gracias a estos análisis, los científicos pueden definir la base molecular de las diferencias fenotípicas y seleccionar los genes diana para estudios de mayor profundidad. El perfil de expresión génica proporciona una información muy valiosa en la función de expresión genética diferencial en estados biológicos normales y enfermedades.

Análisis de expresión de miARN

Los perfiles de expresión de microRNA (miRNA) comparan de manera simultánea los niveles de expresión de varios miARN o miARN únicos entre dos o más muestras. Gracias a estos análisis, los científicos pueden identificar y cuantificar el miARN como biomarcador en enfermedades agudas, como el cáncer. Proporciona información muy valiosa sobre la función de la expresión de miARN en estados biológicos normales y enfermedades.

Detección de microrganismos patógenos microbianos

La combinación de velocidad, alta sensibilidad, precisión y cuantificación absoluta es esencial para la detección de microrganismos patógenos y el análisis de microbiomas en el sector de la salud pública y la epidemiología. Es fundamental para llevar a cabo estudios filogénicos para la identificación, detección, caracterización y monitorización de cambios en patógenos y microbiomas. El área de aplicación es amplia y abarca microrganismos patógenos en los alimentos, resistencia a los fármacos, investigación de microrganismos patógenos, investigación de genes de resistencia a los antimicrobianos, etc. En la detección de microrganismos patógenos, los patógenos microbianos se detectan de forma simultánea con virus, como en la relación virus/bacteria-huésped.

Cuantificación de carga vírica

Las pruebas de carga vírica miden la cantidad de un virus específico en una muestra biológica. Los resultados se indican como el número de copias del ARN vírico por mililitro de muestra. Las pruebas de carga vírica se utilizan para diagnosticar infecciones víricas agudas, proporcionar orientación en la elección de tratamientos y supervisar la respuesta a los tratamientos médicos.

Biopsia líquida

Una biopsia líquida, también conocida como biopsia de fluidos o biopsia en fase de fluido, es el muestreo y análisis de un tejido biológico que no es sólido (por lo general, sangre). Se utiliza fundamentalmente como herramienta de diagnóstico y monitorización en enfermedades como el cáncer. La biopsia líquida es menos invasiva para el donante en comparación con la biopsia de tejidos. Cuando las células tumorales mueren, liberan ctDNA a la sangre. Las mutaciones del cáncer en el ctDNA reflejan lo que se detecta en las biopsias tumorales tradicionales, por lo que pueden emplearse como biomarcadores para llevar a cabo un seguimiento de la enfermedad. El mayor problema se debe a la baja concentración de ctDNA de las células tumorales de la sangre. El método de referencia ha sido usar la NGS, la pirosecuenciación o la qPCR en tiempo real, pero el gran problema de estos métodos es su baja condición en cuanto al límite de detección (LOD). La pirosecuenciación de tejido tumoral se encuentra alrededor del 10 %, las técnicas de NGS se encuentran entre 1–5 % mientras que las qPCR pueden detectar cantidades del 1 %. Esto supone un problema para la reincidencia durante el monitorización de enfermedad residual en el donante, por las limitaciones en los niveles de detección.

Detección de GMO 

Los organismos genéticamente modificados (genetically modified organism, GMO) hacen referencia habitualmente a los cultivos con alteraciones genéticas. La ingeniería genética proporciona la tecnología necesaria para introducir ciertos rasgos deseados, como la resistencia a los virus o insectos, un mayor rendimiento, una composición mejorada, etc. La detección de GMO puede ser cualitativa (presencia) o cuantitativa (cantidad de GMO). Además, puede ser específica de cada evento, es decir, que detecta la presencia de una secuencia de ADN única del GMO específico, o específica de cada constructo, esto es, que detecta la secuencia de ADN extraña insertada en un GMO. Las pruebas de detección de GMO son esenciales para ayudar a que las personas que trabajan en la producción, exportación o importación de cultivos cumplan con los criterios normativos. Las PCR de tiempo real, que son el método más recurrente en la actualidad, están limitadas en la detección y cuantificación de moléculas de ADN diana en baja cantidad, que a menudo se ven en matrices de alimentos complejas. 

Detección de edición genómica (CRISPR-Cas9)

En los estudios de edición genómica, las nucleasas como las proteínas con dedos de zinc (ZFN), el efector TALEN (nucleasa de actividad similar al activador de transcripción) y las repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas de forma regular y agrupadas (CRISPR) son utilizadas para editar los genomas de cualquier célula. Estas nucleasas producen ruptura en el ADN de doble cadena (double-strand breaks, DSB) específico de sitio, que se pueden reparar mediante recombinaciones no homólogas con tendencia a error (NHEJ) (mutación de punto preciso/modelo de donante) o mediante rutas de reparación dirigida por homología (homology-directed repair, HDR) (deleción/inDel/inserción) que generan una mutagénesis dirigida. Como resultado, se desarrolla una población mixta de células con errores de inDel heterogéneos y frecuencias de edición alélica variables. Después, se miden las frecuencias de edición de genomas en el punto deseado. Las líneas celulares clonales aíslan células individuales, donde luego son analizadas para verificar el evento de edición del genoma.

Validación y cuantificación de librerías de NGS

Hoy en día, los procesos de validación y cuantificación de las librerias de NGS se llevan a cabo mediante distintos métodos. El uso de los sistemas espectofotométricos, fluorométricos y por qPCR están limitados en cuanto a la cuantificación precisa de librerias generadas. Contar con una concentración precisa de librerías es fundamental para un proceso de secuenciación rentable y preciso. La metodología de la PCR tiempo real ha sido, hasta el momento, el estándar de oro para la validación de los ensayos de secuenciación. El mayor inconveniente es la falta de precisión cuando se necesita validar alguna detección de su NGS por debajo del 1 %. 

Cuantificación de ADN residual de célula huésped

El proceso de cuantificación de ADN residual de célula huésped se lleva a cabo durante los procesos de fabricación de vacunas y proteínas terapéuticas. Los niveles aceptables se determinan según las agencias regulatorias, como la Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU. y la Organización Mundial de la Salud. Los kits de cuantificación de ADN residual digitales son perfectos para la cuantificación de alta precisión de HCD en bioprocesos complejos.  Algunas de estas células que pasan por un proceso de eliminación durante el desarrollo de terapias genéticas, vacunas basadas en células y bioterapias similares, etc., son, por ejemplo, HEK293, CHO o E. coli.

Publicaciones

Consulte esta amplia lista de artículos en los que se tratan las distintas aplicaciones que utilizan la tecnología de QIAGEN Nanoplate dPCR .

• Huggett JF et al. (2022) Monkeypox: another test for PCR. Euro Surveill., 27(32).
• Amman, F et al. (2022) Viral variant-resolved wastewater surveillance of SARS-CoV-2 at national scale. Nat Biotechnol.
• Tasnim T et al. (2022) A duplex PCR assay for authentication of Ocimum basilicum L. and Ocimum tenuiflorum L in Tulsi churna. Food Control. Volume 137, 108790.
• Alexandra S et al. (2022) Digital PCR can augment the interpretation of RT-qPCR Cq values for SARS-CoV-2 diagnostics. Methods. Volume 201, Pages 5-14.
• Nyaruaba R et al. (2022) Digital PCR applications in the SARS-CoV-2/COVID-19 era: a roadmap for future outbreaks. Clin Microbiol Rev. Sep 21;35(3):e0016821.
• Sun N et al. (2022) Coupling lipid labeling and click chemistry enables isolation of extracellular vesicles for noninvasive detection of oncogenic gene alterations. Adv. Sci., 9, 2105853.
• Piao XM et al. (2022) Expression of RPL9 predicts the recurrence of non-muscle invasive bladder cancer with BCG therapy. Urol Oncol. May;40(5):197.e1-197.e9.
• Zaytseva M et al. (2022) Methodological challenges of digital PCR detection of the histone H3 K27M somatic variant in cerebrospinal fluid. Pathol Oncol Res. Apr 12;28:1610024. 
• Christoph S et al. (2022) Effects of varying flux and transmembrane pressure conditions during ceramic ultrafiltration on the infectivity and retention of MS2 bacteriophages. Separation and Purification Technology. Volume 299, 121709.
• Lindsey AM et al. (2022) Digital polymerase chain reaction strategies for accurate and precise detection of vector copy number in chimeric antigen receptor T-cell products. Cytotherapy.
• Boogaerts T et al. (2021). An alternative approach for bioanalytical assay optimization for wastewater-based epidemiology of SARS-CoV-2. Science of The Total Environment, Volume 789, Article 148043.
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• [Solo versión de preimpresión] Toffoli M et al. (2021) Comprehensive analysis of GBA using a novel algorithm for Illumina whole-genome sequence data or targeted Nanopore sequencing.
• Passera A et al. (2021) Bacterial Communities in the Embryo of Maize Landraces: Relation with Susceptibility to Fusarium Ear Rot. Microorganisms, 9(11), 2388.