¿Qué puede hacer con las PCR digitales?
Tanto si está manipulando muestras preciadas, analizando mutaciones poco frecuentes o estudiando muestras cargadas de inhibidores, la dPCR basada en nanoplacas ofrece datos precisos y reproducibles. El flujo de trabajo rápido y automatizado reduce sustancialmente la variabilidad y mejora la consistencia, al tiempo que es tan sencillo que requiere muy poca formación para dominarlo.
Las PCR digitales, y en concreto la dPCR basada en nanoplacas en QIAcuity, están revolucionando los proyectos de investigación al modificar en esencia las preguntas que se pueden plantear y resolver. El método da impulso a las aplicaciones que antiguamente se veían obstaculizadas por las limitaciones de las qPCR y otras tecnologías de dPCR. Consulte lo que la tecnología puede hacer por sus aplicaciones no clínicas a continuación.
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Detección de mutaciones poco frecuentes
La detección de mutaciones poco frecuentes (rare mutatio detection, RMD) hace referencia a la detección de variantes de secuenciación que están presentes en cantidades bajas en un grupo de moléculas nativas de fondo (menos de 1 % o incluso 0,1 %). Por ello, para detectar y cuantificar eventos poco frecuentes, como mutaciones puntuales o polimorfismos de un solo nucleótido (single nucleotide polymorphisms, SNP), se requiere un método sensible, preciso y exacto. El reto principal es diferenciar entre dos secuencias muy similares, una de las cuales es mucho más abundante que la otra.
Beneficios de usar dPCR basada en nanoplacas para detectar mutaciones poco frecuentes
- Capacidad para cargar un gran volumen de reacción de entrada en 26 000 divisiones, lo que aumenta sustancialmente las opciones de encontrar una diana poco frecuente
- Multiplexado para secuenciación mutante y nativa a fin de detectar fracciones bajas de moléculas mutantes poco frecuentes en un entorno nativo abundante
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Análisis de variación en el número de copias
Los análisis de variación en el número de copias (CNV) determinan el número de copias de un gen en concreto en el genoma de un individuo. Se sabe que los genes se dan en dos copias por genoma. Sin embargo, estos genes pueden aparecer en una frecuencia mayor, en algunos casos. La amplificación génica (que activa los oncogenes) y la eliminación (que desactiva los genes supresores de tumores) son alteraciones del número de copias (CNA) importantes que afectan a los genes relacionados con el cáncer, además de los cambios genómicos como las mutaciones, translocaciones e inversiones. La mayor parte de los genes relacionados con el cáncer y a los que les afectan las CNA se han definido como genes críticos de las vías de detección del cáncer que tienen que ver con la carcinogénesis y el avance de la enfermedad. Las CNV son una fuente fundamental de diversidad genética (eliminación o duplicación de un locus) y posibilitan el estudio de los genes asociado a las enfermedades autoinmunitarias y neurológicas más frecuentes, los trastornos genéticos y las respuestas adversas a fármacos.
Beneficios de usar dPCR basada en nanoplacas para el análisis de las CNV
- Detección de un cambio inferior al 1,2 en CNV, con resultados en unas 2 horas
- Mejora económica y nivel de rendimiento del análisis de CNV con dPCR con Nanoplate 8.5K o capacidades de multiplexado o discriminación más fina de estados de número de copia consecutivas con Nanoplate 26K
- Cálculo automático de CNV con el QIAcuity Software Suite y la posibilidad de diseñar ensayos a medida
Biopsia líquida
Una biopsia líquida, también conocida como biopsia de fluidos o biopsia en fase de fluido, es el muestreo y análisis de un tejido biológico que no es sólido (por lo general, sangre). Se utiliza fundamentalmente como herramienta de diagnóstico y monitorización en enfermedades como el cáncer. La biopsia líquida es menos invasiva para el donante en comparación con la biopsia de tejidos. Cuando las células tumorales mueren, liberan ADNtc a la sangre. Las mutaciones del cáncer en el ADNtc reflejan lo que se detecta en las biopsias tumorales tradicionales, por lo que pueden emplearse como biomarcadores para llevar a cabo un seguimiento de la enfermedad. El mayor problema se debe a la baja concentración de ADNtc de las células tumorales de la sangre. El método de referencia ha sido usar la NGS, la pirosecuenciación o real-time PCR, pero el gran problema de estos métodos es su baja condición en cuanto al límite de detección (LOD). La pirosecuenciación de tejido tumoral se encuentra alrededor del 10 %, las técnicas de NGS se encuentran entre el 1 y el 5 % mientras que las qPCR pueden detectar cantidades de hasta el 1 %. Esto supone un problema para la reincidencia durante la monitorización de enfermedad residual en el donante, por las limitaciones en los niveles de detección.
Beneficios de usar dPCR basada en nanoplacas para el análisis de biopsia líquida
- Se pueden cargar muestras de hasta 28 µl para aumentar el LOD y minimizar el error de submuestreo con QIAcuity Nanoplate 26K, que le permite generar más puntos de datos para fijar los pequeños cambios de la expresión o para la monitorización de enfermedades residuales
- Detección de mutaciones ultra raras de hasta un 0,01 % de frecuencia alélica variante
- Se pueden manipular más muestras primarias, como sangre total y orina, ya que la medición mediante dPCR no se ve afectada por la eficacia de la amplificación.
Detección de microbios
El progresivo aumento de la prevalencia de las enfermedades infecciosas y los brotes epidémicos subraya la necesidad de mejorar la detección y el análisis de microbios, en especial de agentes patógenos. La combinación de velocidad, alta sensibilidad, precisión y cuantificación absoluta es esencial para la detección de microrganismos patógenos y el análisis de microbiomas en el sector de la salud pública y la epidemiología. La PCR digital, como método rápido, sensible y preciso, proporciona muchas ventajas para identificar, detectar, caracterizar y supervisar los cambios en microrganismos patógenos y microbiomas. Las áreas de aplicación de la dPCR en la detección microbiana van desde los microrganismos patógenos en los alimentos, la resistencia a los fármacos, la investigación de microrganismos patógenos, la investigación de genes de resistencia a los antimicrobianos al análisis de las relaciones virus/bacteria-huésped.
Beneficios de la dPCR basada en nanoplacas para la detección microbiana
- Cuantificación precisa y absoluta de material microbiano incluso para muestras complejas o muestras con niveles elevados de inhibidores
- Mayores volúmenes de muestras (hasta 28 µl) con Nanoplate 26K para aumentar la sensibilidad y detectar dianas por debajo de los límites de detección de otros ensayos comercializados
- Es posible el multiplexado de hasta 12 ensayos con una selección de ensayos diseñados a medida o más de 700 ensayos del catálogo para dianas microbianas (bacterianas, víricas, factores de virulencia, AMG, etc.)
Cuantificación de carga vírica
Las pruebas de carga vírica miden la cantidad de un virus específico en una muestra biológica. Los resultados se indican como el número de copias del ARN vírico por mililitro de muestra. Las pruebas de carga vírica se utilizan para diagnosticar infecciones víricas agudas, proporcionar orientación en la elección de tratamientos y supervisar la respuesta a los tratamientos médicos.
Beneficios de usar dPCR basada en nanoplacas para detectar genes virulentos
- Detección de genes de abundancia baja con Nanoplate 26K, lo que le permite generar mayor número de divisiones por muestra con un volumen de carga de muestra más elevado
- Capacidad para analizar dianas microbianas y víricas, con detección muy específica únicamente de las secuencias de interés
- Análisis preciso y eficiente mediante multiplexado de hasta 12 dianas en una reacción
Terapia celular y génica
La PCR digital habilita una gama de aplicaciones de terapia génica, incluido el título del genoma del vector del virus adenoasociado, las mediciones del número de copias de vector lentivírico y el desarrollo y la fabricación de terapias de células T con receptores quiméricos de antígenos (Chimeric Antigen Receptor, CAR). Esto es fundamental en el desarrollo de terapias génicas y celulares eficaces y reproducibles al tiempo que se garantiza la seguridad del paciente.
Medición del título vírico
Descubra cómo el QIAcuity dPCR puede generar el mismo nivel de exactitud y precisión en la cuantificación de la concentración vírica que el método de ddPCR tradicional con una velocidad mayor y un rendimiento y escalabilidad más elevados en general. Descubra un flujo de trabajo completo desde la lisis del vector vírico a la cuantificación del ADN residual pasando por la titulación del genoma vector y la determinación de la integridad del genoma con una precisión, reproducibilidad y velocidad superior.
Beneficios de usar dPCR basada en nanoplacas para la titulación de AAV
- Determinación consistente y robusta de la titulación final gracias a una lisis de cápside eficiente y a la extracción de ADN residual con nuestros kits especializados
- Reducción de errores y fácil implementación con un protocolo con un número mínimo de pasos manuales y solo 10 minutos de manipulación
- Mayor precisión y flexibilidad gracias al multiplexado con hasta 10 ensayos de diana única con diferentes combinaciones de colorantes; opción de ampliar a 12 la capacidad de multiplexado con ensayos de genes de interés (GOI, genes of interest).
- Evaluación precisa de la integridad del genoma con hasta 12 dianas simultáneamente activadas por nuestra función avanzada de QIAcuity Software
Cuantificación de ADN residual de célula huésped
El proceso de cuantificación de ADN residual de célula huésped (HCD, host cell DNA) se lleva a cabo durante los proceso de fabricación de productos biofarmacéuticos. Los niveles aceptables se determinan según las agencias regulatorias, como Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos y la Organización Mundial de la Salud. Los kits de cuantificación de ADN residual digitales son perfectos para la cuantificación de alta precisión de HCD en bioprocesos complejos. Las células huésped habituales usadas durante el desarrollo de los tratamientos genéticos, las proteínas terapéuticas y otras bioterapias incluyen células de riñón embrionario humano 293 (Human Embryonic Kidney 293, HEK293), células de ovario de hámster chino (Chinese Hamster Ovary, CHO) y E. coli.
Beneficios de usar dPCR basada en nanoplacas para la cuantificación de ADN residual de célula huésped
- Facilidad de configuración y detección del ADN de células huésped gracias a una mezcla maestra premezclada y a un control positivo/interno
- Detección precisa de ADN residual E. coli, CHO y HEK293 a femtogramos bajos, incluso en presencia de contaminantes e inhibidores de PCR
- Los ensayos de dianas multicopia específicos para cada especie garantizan resultados que no se ven afectados por el nivel de fragmentación del ADNres
- Validación de la exactitud de la cuantificación o posibilidad de realizar estudios puente utilizando los estándares verificados por dPCR
Detección de micoplasma
Los micoplasmas son contaminantes de productos biológicos derivados de líneas celulares en la industria biofarmacéutica. Los micoplasmas pueden aparecer en cultivos celulares como resultado de la contaminación de las mismas líneas celulares de origen (sustratos celulares) o de la introducción accidental de micoplasmas durante la producción. Existen múltiples directrices sobre riesgos de contaminación y documentos técnicos sobre la seguridad frente a micoplasmas en la fabricación de productos biológicos.
La PCR digital se puede utilizar para detectar la contaminación en cultivos celulares y otros productos biológicos derivados de cultivos celulares. Por ejemplo, el QIAcuity Mycoplasma Quant Kit es un kit RT-dPCR que detecta ARNr y ADN, lo que permite una alta sensibilidad del método. Un control de amplificación interno evita falsos negativos debido a inhibidores de PCR, extracción inapropiada de ARN o reacción inapropiada de RT. Los ensayos basados en sondas pueden cuantificar y detectar 127 especies de micoplasmas distintos.
Beneficios de usar dPCR basada en nanoplacas para la detección de micoplasmas
- Cumplimiento: Flujo de trabajo de técnica del ácido nucleico (NAT, Nucleic Acid Technique) para análisis de micoplasma, que cumple con la farmacopea europea, estadounidense y japonesa
- Rapidez: No es necesario el cultivo de micoplasmas, que requiere mucho tiempo
- Sensibilidad: La detección de ARNr permite una mayor sensibilidad que cuando solo se utiliza ADN, ya que las diversas copias presentan una única célula bacteriana (detección de <10 UCF/ml). Este ensayo todavía puede detectar ADN si se omite el paso de RT, lo que permite un mayor grado de flexibilidad.
- Validación previa: El flujo de trabajo se ha probado sobradamente como parte de un informe de validación completo que puede reducir sus propios esfuerzos de validación.
- Diez Mycoplasma Standard CFU Kits para validación in situ o como control positivo sin introducir micoplasma vital
Análisis de expresión génica
El perfil de expresión génica compara de manera simultánea los niveles de expresión de varios genes entre dos o más muestras. Gracias a estos análisis, los científicos pueden definir la base molecular de las diferencias fenotípicas y seleccionar los genes diana para estudios de mayor profundidad. El perfil de expresión génica proporciona una información muy valiosa en la función de expresión génica diferencial en estados biológicos normales y enfermedades.
Beneficios de la dPCR basada en nanoplacas para la cuantificación de la expresión génica
- Detecte los cambios más sutiles, especialmente en cantidades de molde bajas
- Valide los resultados con una concentración absoluta y una abundancia inferior al 1 % según la cantidad de muestra que introduzca
- Consiga un alto nivel de precisión y una alta gama dinámica de log5 con Nanoplate 26K o lleve a cabo análisis económicos con reacciones de 12 µl y opciones de alto rendimiento para elementos diana expresados de manera similar en una Nanoplate 8.5K (cambios de expresión hasta 4 veces mayor)
Análisis de expresión de miARN
Los perfiles de expresión de microRNA (miRNA) comparan de manera simultánea los niveles de expresión de varios miARN o miARN únicos entre dos o más muestras. Gracias a estos análisis, los científicos pueden identificar y cuantificar el miARN como biomarcador en enfermedades como el cáncer. Proporciona información muy valiosa sobre la función de la expresión de miARN en estados biológicos normales y enfermedades.
Beneficios de la dPCR basada en nanoplacas para el análisis de expresión de miARN
- Discriminación de las diferencias de un solo nucleótido en secuencias estrechamente relacionadas con los miARN gracias a la alta especificidad de la dPCR
- La cuantificación absoluta la expresión sutil de miARN cambia, especialmente en cantidades de molde bajas
Análisis alimentario
Los ensayos de PCR digital multiplex abarcan una amplio espectro de aplicaciones de la industria alimentaria, incluidos el control normativo, la garantía de calidad, las pruebas de detección de GMO, la detección de adulteraciones alimentarias y la supervisión de enfermedades de origen alimentario. Estos ensayos pueden identificar especies de animales y hacer un seguimiento del origen de los productos cárnicos, es decir, pueden distinguir entre cerdo, camello, oveja, burro, cabra, vaca y pollo en una sola reacción. También se utilizan para cuantificar transgenes en las pruebas de detección de GMO, con estudios que muestran mayor sensibilidad y repetibilidad en comparación con la qPCR. Para detectar adulteraciones alimentarias, los ensayos de dPCR pueden identificar ingredientes de origen animal en productos vegetarianos o veganos centrándose en marcadores específicos de ADN mitocondrial y cloroplástico. Además, la dPCR es efectiva a la hora de detectar simultáneamente diversos agentes patógenos microbianos, como E. coli, L. monocytogenes, S. aureus y S. enterica, lo que garantiza la seguridad y la calidad de los alimentos.
Beneficios de usar dPCR basada en nanoplacas para el análisis de alimentos
- Ideal para muestras de matriz compleja gracias al multiplexado y la capacidad de la dPCR de minimizar el efecto de las eficiencias de amplificación causadas por las diferencias de matriz entre el material de referencia y las muestras
- Posibilidades de alto rendimiento gracias al multiplexado y a un sistema de 8 placas
- Detección fiable de eventos de GMO poco frecuentes debido al bajo ruido de fondo gracias a la generación de particiones
Análisis de célula única
En comparación los métodos tradicionales de análisis de poblaciones celulares a granel, el análisis de célula única puede obtener datos a nivel de la célula única, lo que ayuda a los investigadores a comprender mejor la heterogeneidad celular, las funciones biológicas, los procesos y los mecanismos de las enfermedades. Los métodos utilizados habitualmente para el análisis de células únicas, como la PCR, la qPCR o la secuenciación de última generación (NGS), carecen a veces de la sensibilidad necesaria para detectar la diana de interés.
La PCR digital es una opción cada vez más de moda para el análisis de células únicas, gracias a las plataformas de dPCR, que son rentables, intuitivas y exactas, y que ofrecen alto rendimiento y alta sensibilidad de detección y precisión.
Beneficios de usar dPCR basada en nanoplacas para el análisis de células únicas
- Mucha exactitud con las divisiones físicas, que son mucho más estables que las gotículas
- La detección basada en sondas permite el multiplexado de hasta 12 dianas en una sola reacción de dPCR con una optimización mínima
- La precisión de los resultados permite el análisis de dianas de abundancia baja y dianas multicopia en un nivel de células únicas
Detección de edición genómica (CRISPR-Cas9)
Las nucleasas como las proteínas con dedos de zinc (ZFN), el efector TALEN (nucleasa de actividad similar al activador de transcripción) y las repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas de forma regular y agrupadas (CRISPR) son utilizadas para editar los genomas de cualquier célula. Estas nucleasas producen ruptura en el ADN de doble cadena (double-strand breaks, DSB) específico de sitio, que se pueden reparar mediante recombinaciones no homólogas con tendencia a error (NHEJ) (mutación de punto preciso/modelo de donante) o mediante rutas de reparación dirigida por homología (homology-directed repair, HDR) (deleción/inDel/inserción) que generan una mutagénesis dirigida. Como resultado, se desarrolla una población mixta de células con errores de inDel heterogéneos y frecuencias de edición alélica variables. Después, se miden las frecuencias de edición de genomas en el punto deseado. Las líneas celulares clonales aíslan células individuales, donde luego son analizadas para verificar el evento de edición del genoma.
Beneficios de usar dPCR basada en nanoplacas para la detección de ediciones genómicas (CRISPR-Cas9)
- El elevado grado de sensibilidad posibilita la detección de eventos de edición presentes a frecuencias superiores al 0,5 %
- Cuantificación absoluta de eventos de edición a partir de solo 5 ng de gADN total
- Capacidad para distinguir entre ediciones homocigóticas y heterocigóticas en poblaciones clonales
Cuantificación de genotecas de NGS
La cuantificación de las genotecas de secuenciación de última generación es un paso esencial para usar sus celdas de flujo con todo su potencial. Las pruebas muestran que la carga excesiva o insuficiente de una genoteca de NGS tras una cuantificación de genoteca imprecisa afecta de manera negativa a la calidad y la salida de datos. El uso de la PCR digital para determinar la concentración absoluta de un grupo de genotecas de NGS puede ser muy beneficioso para obtener un rendimiento óptimo y reducir el coste por muestra.
Beneficios de usar PCR digital basada en nanoplacas para la cuantificación de genotecas de NGS
- Cuantificación absoluta de fragmentos de genotecas amplificables sin sesgo de amplificación y sin sesgo estándar con resultados en 2 horas, idónea para análisis rutinarios
- Alta reproducibilidad y uniformidad superior para grupos de genotecas con cobertura de todos los tipos de genotecas de Illumina con un ensayo
Cuantificación e interacción de proteínas
La tecnología de acoplamiento de interacciones de proteínas (Protein Interaction Coupling, PICO) de Actome se beneficia del QIAcuity Digital PCR System para ofrecer un enfoque muy versátil y sensible a fin de detectar y cuantificar proteínas únicas e interacciones proteicas. La tecnología PICO traduce el estado de proteínas complejas en códigos de barras de ADN que pueden amplificarse y detectarse mediante dPCR. Esto es especialmente útil al investigar rutas celulares, buscar biomarcadores proteicos, desarrollar ensayos nuevos para investigación farmacéutica o hacer análisis multi-omics.
Beneficios de usar dPCR basada en nanoplacas para la detección de proteínas.
- La única tecnología del mercado que sirve para cuantificar proteínas mediante dPCR
- Detección de proteínas, interacción proteína-proteína y modificaciones postranslacionales en cuanto a células únicas
