Applications de la PCR digitale

Détection des mutations rares

La détection des mutations rares (RMD) est la détection d’un variant de séquence qui n’est que très faiblement présent dans un pool de fonds de type sauvage (moins de 1 % ou même 0,1 %). Ainsi, pour détecter et quantifier des événements rares, tels que les mutations ponctuelles ou les polymorphismes mononucléotidiques (SNP), il faut une méthode sensible et d’une grande précision. Le défi consiste à distinguer deux séquences particulièrement similaires, l’une étant nettement plus abondante que l’autre.

La détection d’une mutation mononucléotidique peu fréquente dans un échantillon de biopsie en cas de cancer est un exemple de détection de mutations rares.

Analyse de variation du nombre de copies 

L’analyse de variation du nombre de copies (CNV) permet de déterminer le nombre de copies d’un gène spécifique dans un génome donné. On sait qu’il y a deux copies de gènes par génome, mais ces gènes peuvent être plus nombreux dans certains cas. L’amplification (qui active les oncogènes) et la délétion (qui inactive les gènes suppresseurs de tumeur) des gènes constituent d’importantes altérations du nombre de copies (CNA) qui affectent les gènes liés au cancer, en plus des altérations génomiques telles que les mutations ponctuelles, les translocations et les inversions. La plupart des gènes liés au cancer affectés par les CNA ont été définis comme des gènes primordiaux dans les voies de signalisation du cancer impliquées dans la carcinogenèse et l’évolution du cancer. Les CNV sont une source essentielle de diversité génétique (délétion ou duplication d’un locus), elles permettent d’étudier les gènes associés à des maladies neurologiques et auto-immunes courantes, des affections génétiques et de mauvaises réponses au traitement.

Analyse d’expression génique

Le profilage de l’expression génique compare simultanément les niveaux d’expression de plusieurs gènes entre deux ou plusieurs échantillons. Cette analyse peut aider les chercheurs à définir la base moléculaire des différences phénotypiques et à sélectionner les cibles de gènes pour une étude approfondie. Le profilage de l’expression génique offre un aperçu précieux du rôle de l’expression génique différentielle dans les états biologiques sains et pathologiques.

Analyse d’expression du micro-ARN

Le profilage de l’expression du micro-ARN (miARN) compare simultanément les niveaux d’expression d’un ou plusieurs micro-ARN entre deux ou plusieurs échantillons. Cette analyse peut aider les chercheurs à identifier et quantifier le micro-ARN comme biomarqueur d’affections aiguës telles que le cancer. Elle offre un aperçu précieux du rôle de l’expression du micro-ARN dans les états biologiques sains et pathologiques.

Détection des agents pathogènes microbiens

L’association de la rapidité, de la sensibilité élevée, de la précision et de la quantification absolue est primordiale pour la détection des agents pathogènes et l’analyse du microbiome dans les domaines de la santé publique et de l’épidémiologie. Elle est impérative pour l’étude de la phylogénie à des fins d’identification, détection, caractérisation et surveillance des changements des agents pathogènes et du microbiome. Le domaine d’application est vaste : agents pathogènes dans l’alimentation, pharmacorésistance, recherche de micro-organismes, étude des gènes de l’antibiorésistance, etc. Pour la détection des agents pathogènes, les agents pathogènes microbiens sont souvent détectés en même temps que des virus, comme dans le cas de l’interaction entre le virus/la bactérie et l’hôte.

Quantification de la charge virale

Le test de la charge virale permet de mesurer la quantité d’un virus spécifique dans un échantillon biologique. Les résultats sont présentés en nombre de copies de l’ARN viral par millilitre d’échantillon. Les tests de la charge virale permettent de diagnostiquer les infections virales aiguës, d’orienter le choix du traitement et de surveiller la réponse au traitement médical.

Biopsie liquide

Une biopsie liquide, également appelée biopsie des fluides, consiste à échantillonner et analyser des tissus biologiques non solides, principalement du sang. Elle est avant tout utilisée comme outil de diagnostic et de surveillance de maladies telles que le cancer. La biopsie liquide est moins invasive pour le donneur que la biopsie tissulaire. Lorsque des cellules tumorales meurent, elles libèrent de l’ADNtc dans le sang. Les mutations cancéreuses dans l’ADNtc reflètent celles qui sont détectées dans les biopsies tumorales standard, elles peuvent ainsi être utilisées comme biomarqueurs moléculaires pour le suivi de la maladie. Le problème, c’est la faible concentration d’ADNtc dans les cellules tumorales du sang. La référence en la matière est l’utilisation du séquençage à haut débit (NGS), du pyroséquençage ou de la qPCR en temps réel, mais l’inconvénient de ces méthodes est leur limite de détection (LOD) restreinte. Le pyroséquençage pour les tissus tumoraux est d’environ 10 %, le NGS est entre 1 et 5 %, et la capacité de détection de la qPCR est de l’ordre de 1 %. Cela pose un vrai problème de rechute au cours de la surveillance de la maladie résiduelle du donneur eu égard à la limite des niveaux de détection.

Détection des OGM 

Un organisme génétiquement modifié (OGM) fait généralement référence à des cultures dont la génétique a été modifiée. Le génie génétique apporte la technologie qui permet d’introduire certaines caractéristiques souhaitées, telles que la résistance aux virus/insectes, le rendement accru des cultures, une meilleure composition, etc. La détection des OGM peut être qualitative (présence) ou quantitative (quantité d’OGM). Elle peut être propre à un événement, dans ce cas elle détecte la présence d’une séquence d’ADN unique à l’OGM en question, ou propre à la structure, dans ce cas elle détecte une séquence d’ADN étrangère introduite dans un OGM. Le test d’OGM est nécessaire à bon nombre de cultivateurs/exportateurs/importateurs pour être conformes à la réglementation en vigueur. La real-time PCR, qui est actuellement la méthode privilégiée, est limitée en matière de détection et quantification de cibles d’ADN faibles, souvent détectées dans des matrices alimentaires complexes. 

Détection de l’édition génomique (CRISPR-Cas9)

Dans les études d’édition génomique, on utilise des nucléases à doigt de zinc (NDZ) ou à effecteur de type activateur de transcription (TALEN) et les courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées (CRISPR) pour modifier le génome des cellules. Ces nucléases produisent des cassures double brin (CDB) d’ADN spécifique, qui peuvent ensuite être réparées par une ligature d’extrémités non homologues (NHEJ) imprécise et pouvant être erronée (matrice du donneur/mutation ponctuelle précise) ou par une réparation par homologie (HDR) (délétion/insertions-délétions/insertions) entraînant une mutagenèse ciblée. Ainsi, une population mixte de cellules présentant des erreurs d’insertions-délétions hétérogènes et des fréquences d’édition allélique variables se développe. Ensuite, on mesure les fréquences d’édition génomique au niveau du locus souhaité. Les lignées cellulaires clonales isolent les cellules individuelles, qui sont ensuite dosées afin de vérifier l’événement d’édition génomique.

Quantification et validation de banques de NGS

La quantification et la validation de banques de NGS s’effectuent de nos jours avec diverses méthodes. Le recours aux systèmes de spectrophotométrie et fluorimétrie et à la qPCR ne permet pas de quantifier avec suffisamment de précision les banques générées. La concentration précise de vos banques est impérative pour un cycle de séquençage efficient et précis. La real-time PCR est jusqu’à présent la référence absolue en matière de validation du cycle de séquençage. Son inconvénient est le manque de précision lorsque vous devez valider les résultats dans votre NGS en deçà de 1 %. 

Quantification de l’ADN résiduel des cellules hôtes

L’ADN de cellules hôtes ou ADN résiduel (ADNr) est transféré lors du processus de fabrication des protéines thérapeutiques et des vaccins. Les taux acceptables sont définis par les organismes de réglementation tels que la Food and Drug Administration (FDA) et l’Organisation mondiale de la Santé (OMS). Les kits de quantification de l’ADN résiduel sont parfaits pour une quantification très précise de l’ADNr dans les bioprocédés complexes. Les cellules qui subissent une épuration au cours du développement des thérapies géniques, des vaccins à base de cellules ou d’autres biothérapies similaires peuvent être de type HEK293, CHO ou E. coli.

Publications

Parcourez notre liste d’articles sans cesse actualisée, ils abordent les applications utilisant la technologie de dPCR sur nanoplaques de QIAGEN.

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• Alexandra S et al. (2022) Digital PCR can augment the interpretation of RT-qPCR Cq values for SARS-CoV-2 diagnostics. Methods. Volume 201, Pages 5-14.
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