Que pouvez-vous faire avec la PCR digitale ?
Que vous traitiez des échantillons précieux, analysiez des mutations ou étudiez des échantillons pleins d’inhibiteurs, la dPCR sur nanoplaques offre des données précises et reproductibles. Le flux de travail rapide et automatisé réduit considérablement la variabilité et améliore la cohérence tout en étant très simple, car il n’exige que très peu d’entraînement avant d’être maîtrisé.
La PCR digitale, plus particulièrement la dPCR sur nanoplaques sur QIAcuity, révolutionne la recherche en répondant dès aujourd’hui à vos questions. La méthode alimente les applications dont les limites des technologies de qPCR et de dPCR constituaient autrefois un obstacle. Voyez ci-après ce que cette technologie peut apporter dans votre application non clinique.
Un intérêt pour les applications cliniques de la PCR digitale ? Cliquez ici pour en savoir plus.
Détection des mutations rares
La détection des mutations rares (RMD) est la détection d’un variant de séquence qui n’est que très faiblement présent dans un pool de fonds de type sauvage (moins de 1 % ou même 0,1 %). Ainsi, pour détecter et quantifier des événements rares, tels que les mutations ponctuelles ou les polymorphismes mononucléotidiques (SNP), il faut une méthode sensible et d’une grande précision. Le défi consiste à distinguer deux séquences particulièrement similaires, l’une étant nettement plus abondante que l’autre.
Avantages de l’utilisation de la dPCR sur nanoplaques pour la détection des mutations rares
- Capacité à charger un grand volume réactionnel d’entrée dans 26 000 fractions, ce qui augmente considérablement les chances de détecter une cible rare
- Multiplexage pour séquençage mutant et de type sauvage afin de détecter de faibles fractions de molécules mutantes rares dans le cas d’un fond de type sauvage abondant
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L’analyse des variations du nombre de copies
L’analyse de variation du nombre de copies (VNC) permet de déterminer le nombre de copies d’un gène spécifique dans un génome donné. On sait qu’il y a deux copies de gènes par génome, mais ces gènes peuvent être plus nombreux dans certains cas. L’amplification (qui active les oncogènes) et la délétion (qui inactive les gènes suppresseurs de tumeurs) des gènes constituent d’importantes altérations du nombre de copies (CNA) qui affectent les gènes liés au cancer, en plus des altérations génomiques telles que les mutations ponctuelles, les translocations et les inversions. La plupart des gènes liés au cancer affectés par les CNA ont été définis comme gènes critiques dans les voies de signalisation du cancer impliquées dans la carcinogenèse et la progression du cancer. Les VNC sont une source essentielle de diversité génétique (délétion ou duplication d’un locus), elles permettent d’étudier les gènes associés à des maladies neurologiques et auto-immunes courantes, des affections génétiques et de mauvaises réponses au traitement.
Avantages de l’utilisation de la dPCR sur nanoplaques pour l’analyse des VNC
- Détection de changement inférieur à 1,2 fois dans les VNC, avec des résultats en 2 heures environ
- Meilleur niveau de débit et d’économie de l’analyse des VNC par dPCR grâce à la nanoplaque 8.5K ou capacités de multiplexage ou la discrimination précise encore des nombres de copies consécutifs grâce à la nanoplaque 26K
- Calcul automatique des VNC grâce à QIAcuity Software Suite et à la possibilité de concevoir des dosages sur mesure
Biopsie liquide
Une biopsie liquide, également appelée biopsie des fluides ou biopsie en phase fluide, consiste à échantillonner et à analyser des tissus biologiques non solides, principalement du sang. Elle est avant tout utilisée comme outil de diagnostic et de surveillance de maladies telles que le cancer. La biopsie liquide est moins invasive pour le donneur que la biopsie tissulaire. Lorsque des cellules tumorales meurent, elles libèrent de l’ADNtc dans le sang. Les mutations cancéreuses dans l’ADNtc reflètent celles qui sont détectées dans les biopsies tumorales standard, elles peuvent ainsi être utilisées comme biomarqueurs moléculaires pour le suivi de la maladie. Le problème concerne la faible concentration d’ADNtc dans les cellules tumorales du sang. La référence en la matière est l’utilisation du séquençage à haut débit (NGS), du pyroséquençage ou de la qPCR en temps réel, mais l’inconvénient de ces méthodes est leur limite de détection (LOD) restreinte. Le pyroséquençage pour les tissus tumoraux est d’environ 10 %, le NGS est entre 1 et 5 %, et la capacité de détection de la qPCR est de l’ordre de 1 %. Cela pose un vrai problème de rechute au cours de la surveillance de la maladie résiduelle du donneur eu égard à la limite des niveaux de détection.
Avantages de l’utilisation de la dPCR sur nanoplaques pour l’analyse des biopsies liquides
- Chargement jusqu’à 28 µl d’échantillon afin d’augmenter la LOD et de limiter l’erreur de sous-échantillonnage grâce à la QIAcuity Nanoplate 26K : ce qui vous permet de générer davantage de points de données pour sécuriser les petits changements d’expression ou pour la surveillance des maladies résiduelles
- Détection des mutations ultra-rares en pouvant descendre jusqu’à 0,01 % de la fréquence allélique des variants
- Gestion des échantillons plus bruts, comme le sang total et l’urine, puisque l’efficacité de l’amplification n’a aucune incidence sur la mesure de la dPCR
Détection microbienne
L’augmentation de la prévalence des maladies infectieuses et des épidémies souligne le besoin d’une détection et d’une analyse renforcées des microbes, plus particulièrement des agents pathogènes. L’association de la rapidité, de la sensibilité élevée, de la précision et de la quantification absolue est primordiale pour la détection des agents pathogènes et l’analyse du microbiome dans les domaines de la santé publique et de l’épidémiologie. La PCR digitale, en tant que méthode rapide, sensible et précise, est extrêmement bénéfique pour l’identification, la détection, la caractérisation et la surveillance des changements concernant les agents pathogènes et les microbiomes. Les domaines d’application de la dPCR dans la détection microbienne englobent les agents pathogènes dans l’alimentation, la pharmacorésistance, la recherche de micro-organismes, l’étude des gènes de l’antibiorésistance et l’analyse des interactions entre le virus / la bactérie et l’hôte.
Avantages de l’utilisation de la dPCR sur nanoplaques pour la détection microbienne
- Quantification absolue et précise de substances microbiennes, même dans des échantillons complexes ou des échantillons présentant des niveaux d’inhibiteurs élevés
- Volumes d’échantillon plus importants (jusqu’à 28 µl) avec la nanoplaque 26K pour optimiser la sensibilité et la détection des cibles en dessous des limites de détection des autres dosages commerciaux
- Multiplexage possible de 12 dosages maximum avec une sélection de dosages sur mesure ou plus de 700 dosages de catalogue pour les cibles microbiennes (bactéries, virus, facteurs de virulence, AMG, etc.)
Quantification de la charge virale
Le test de la charge virale permet de mesurer la quantité d’un virus spécifique dans un échantillon biologique. Les résultats sont présentés en nombre de copies de l’ARN viral par millilitre d’échantillon. Les tests de la charge virale permettent de diagnostiquer les infections virales aiguës, d’orienter le choix du traitement et de surveiller la réponse au traitement médical.
Avantages de l’utilisation de la dPCR sur nanoplaques pour la détection des gènes de virulence
- Détection des gènes peu abondants grâce à la nanoplaque 26K qui permet davantage de fractionnement par échantillon et un volume de charge d’échantillon plus important
- Capacité à analyser les cibles microbiennes et virales, grâce à une détection hautement spécifique de la séquence d’intérêt uniquement
- Analyse précise et efficace en multiplexant jusqu’à 12 cibles dans une réaction
La thérapie génique et cellulaire
La PCR digitale permet une série d’applications de thérapie génique, notamment la mesure du titre du génome des vecteurs des virus adéno-associés, du nombre de copies des vecteurs lentiviraux, le développement et la fabrication de thérapies par lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR-T). Cet aspect est essentiel pour développer des thérapies cellulaires et géniques efficaces et reproductibles tout en garantissant la sécurité des patients.
Mesure du titre viral
Découvrez comment la dPCR QIAcuity peut offrir le même niveau d’exactitude et de précision en quantification du titre viral que la méthode de ddPCR classique, mais avec une rapidité accrue et un débit et une flexibilité globalement supérieurs. Découvrez un flux de travail complet allant de la lyse du vecteur viral à la quantification de l’ADN résiduel en passant par le titrage du génome du vecteur et la détermination de l’intégrité du génome grâce à une précision, une reproductibilité et une rapidité accrues.
Avantages de l’utilisation de la dPCR sur nanoplaques pour le titrage des VAA
- Détermination homogène et fiable du titrage final grâce à une lyse efficace de la capside et à un retrait de l’ADN résiduel avec nos kits spécialisés
- Réduction des erreurs et mise en œuvre facile grâce à un seul protocole comprenant un nombre minimal d’étapes manuelles et une durée de manipulation de 10 minutes seulement
- Précision et flexibilité accrues grâce au multiplexage avec maximum 10 dosages cibles seuls associés à différentes combinaisons de colorants ; possibilité d’étendre à une capacité de 12-plex avec les dosages des gènes d’ intérêts
- Évaluation précise de l’intégrité du génome à l’aide de 12 cibles maximum en simultanée grâce à notre fonctionnalité de logiciel QIAcuity avancée
Quantification de l’ADN résiduel des cellules hôtes
L’ADN de cellules hôtes ou ADN résiduel (ADNr) est transféré lors des processus de fabrication de produits biopharmaceutiques. Les taux acceptables sont définis par les organismes de réglementation tels que la Food and Drug Administration (FDA) aux États-Unis et l’Organisation mondiale de la Santé (OMS). Les kits de quantification de l’ADN résiduel sont parfaits pour une quantification très précise de l’ADNr dans les bioprocédés complexes. Les cellules hôtes courantes utilisées pendant le développement des thérapies géniques, des protéines thérapeutiques et d’autres biothérapies incluent les cellules 293 de rein embryonnaire humain (HEK293), les cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) et les cellules d’E. coli.
Avantages de l’utilisation de la dPCR sur nanoplaques pour la quantification de l’ADN résiduel des cellules hôtes
- Configuration et détection simples de l’ADN de cellule hôte grâce à un Master Mix et à un contrôle positif/interne
- Détection précise de l’ADN résiduel d’E. coli, de CHO et de HEK293 à des taux infimes en femtogrammes, même en présence de contaminants PCR et d’autres agents inhibiteurs
- Dosages de cibles multicopies spécifiques à une espèce non affectés par le niveau de fragmentation de l’ADN résiduel
- Validation de la précision de la quantification ou comblement des études possibles grâce aux normes vérifiées pour la dPCR
Détection de mycoplasmes
Les mycoplasmes sont des contaminants de produits biologiques dérivés de lignées cellulaires dans l’industrie biopharmaceutique. Les mycoplasmes peuvent apparaître dans une culture cellulaire à la suite d’une contamination des lignes cellulaires sources elles-mêmes (substrats cellulaires) ou en cas d’introduction accidentelle de mycoplasmes pendant la production. De multiples recommandations sur le risque de contamination et des documents techniques sur la sécurité des mycoplasmes pour la fabrication de produits biologiques sont disponibles.
La PCR digitale peut être utilisée pour détecter une contamination dans les cultures cellulaires et d’autres produits biologiques dérivés de cultures cellulaires. Par exemple, le QIAcuity Mycoplasma Quant Kit est un kit RT-dPCR qui détecte l’ARNr et l’ADN, A, assurant une sensibilité élevée à la méthode. Un contrôle d’amplification interne empêche les faux négatifs dus aux inhibiteurs de PCR, à une extraction incorrecte de l’ARN ou à une réaction RT incorrecte. Le dosage basé sur sonde peut quantifier et détecter 127 espèces de mycoplasmes différentes.
Avantages de l’utilisation de la dPCR sur nanoplaques pour la détection de mycoplasmes
- Conformité : Le flux de travail NAT (technique d’acide nucléique) pour le test des mycoplasmes est conforme aux pharmacopées européennes, américaines et japonaises
- Rapidité : aucune culture chronophage de mycoplasmes n’est nécessaire
- Sensibilité : la détection de l’ARNr assure une sensibilité accrue par rapport à une utilisation seule de l’ADN en raison des multiples copies présentes dans une seule cellule bactérienne (détection < 10 CFU/mL). Le dosage permet toujours de détecter l’ADN si l’étape RT est sautée, assurant un degré de flexibilité élevée.
- Pré-validation : Le flux de travail a été minutieusement testé dans le cadre d’un rapport de validation complet qui peut réduire vos efforts de validation
- Dix Mycoplasma Standard CFU Kits pour une validation interne ou en tant que contrôle positif sans introduire de mycoplasme vital
Analyse de l’expression génique
Le profilage de l’expression génique compare simultanément les niveaux d’expression de plusieurs gènes entre deux ou plusieurs échantillons. Cette analyse peut aider les chercheurs à définir la base moléculaire des différences phénotypiques et à sélectionner les cibles de gènes pour une étude approfondie. Le profilage de l’expression génique offre un aperçu précieux du rôle de l’expression génique différentielle dans les états biologiques sains et pathologiques.
Avantages de l’utilisation de la dPCR sur nanoplaques pour la quantification de l’expression génique
- Détection des changements de moindre ampleur, particulièrement dans les faibles quantités de matrices
- Validation des résultats avec une concentration absolue et une abondance inférieures à 1 % selon la quantité utilisée
- Obtention d’une précision élevée et d’une grande plage dynamique de log5 grâce à la nanoplaque 26K ou réalisation de cycles plus économiques avec des réactions de 12 µl et des options de débit élevé pour des cibles « similaires » exprimées (changement d’expression jusqu’à environ 4 fois) sur une nanoplaque 8.5K
Analyse d’expression du micro-ARN
Le profilage de l’expression du micro-ARN (miARN) compare simultanément les niveaux d’expression d’un ou plusieurs micro-ARN entre deux ou plusieurs échantillons. Cette analyse peut aider les chercheurs à identifier et à quantifier le micro-ARN comme biomarqueur d’affections telles que le cancer. Elle offre un aperçu précieux du rôle de l’expression du micro-ARN dans les états biologiques sains et pathologiques.
Avantages de l’utilisation de la dPCR sur nanoplaques pour l’analyse d’expression du micro-ARN
- Discrimination des différences d’un seul nucléotide dans des micro-ARN étroitement liés grâce à la spécificité élevée de la dPCR
- Quantification absolue des changements subtils de l’expression des micro-ARN, particulièrement dans les faibles quantités de matrices
Test alimentaire
Les dosages de PCR digitale multiplex présentent une large gamme d’applications dans l’industrie alimentaire, notamment le contrôle réglementaire, l’assurance qualité, les tests d’OGM, la détection de la fraude alimentaire et la surveillance des maladies d’origine alimentaire. Ces dosages peuvent identifier des espèces animales et tracer l’origine des produits de viande, comme faire la distinction entre le cochon, le chameau, le mouton, l’âne, la chèvre, la vache et le poulet dans une seule réaction. Ils sont également utilisés pour quantifier les transgènes dans les tests d’OGM, avec des études montrant une sensibilité et une répétabilité plus élevées par rapport à la qPCR. Pour la détection de la fraude alimentaire, les dosages de dPCR peuvent identifier des ingrédients dérivés des animaux dans des produits végétariens ou véganes en ciblant des marqueurs spécifiques de l’ADN mitochondrial et chloroplastique. De plus, la dPCR est efficace pour détecter simultanément de multiples agents pathogènes microbiens, comme E. coli, L. monocytogenes, S. aureus et S. enterica, assurant la sécurité et la qualité alimentaires.
Avantages de l’utilisation de la dPCR sur nanoplaques pour les tests alimentaires
- Idéal pour les échantillons de matrices complexes grâce au multiplexage et à la capacité de la dPCR de limiter l’effet de l’efficacité de l’amplification causé par les différences de matrice entre les matériels de référence et les échantillons
- Possibilités de haut débit grâce au multiplexage et à un système à 8 plaques
- Détection fiable des événements d’OGM rares grâce au fond réduit par le fractionnement
Analyse de cellules individuelles
Par rapport aux méthodes traditionnelles pour l’analyse des populations de cellules en vrac, l’analyse de cellules individuelles peut obtenir des données au niveau unicellulaire, ce qui aide les chercheurs à mieux comprendre l’hétérogénéité cellulaire, les fonctions biologiques, les processus et les mécanismes pathologiques. Les méthodes habituellement utilisées pour l’analyse de cellules individuelles, notamment la PCR, la qPCR ou le séquençage à haut débit (NGS), manquent parfois de sensibilité, ce qui est requis pour détecter la cible d’intérêt.
La PCR digitale constitue une option émergente pour l’analyse de cellules individuelles, en raison des plateformes de dPCR rentables, intuitives et précises qui offrent un haut débit et une sensibilité élevée concernant la détection et la précision.
Avantages de l’utilisation de la dPCR sur nanoplaques pour l’analyse de cellules individuelles
- Précision élevée avec un fractionnement physique qui est plus stable que les gouttelettes
- La détection basée sur une sonde permet le multiplexage de 12 cibles maximum dans une seule réaction de dPCR avec une optimisation minimale
- Des résultats précis permettent une analyse des cibles peu abondantes et la multicopie des cibles à un niveau unicellulaire
Détection de l’édition génomique (CRISPR-Cas9)
Les nucléases à doigt de zinc (NDZ) ou à effecteur de type activateur de transcription (TALEN) et les courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées (CRISPR) sont utilisées pour modifier le génome des cellules. Ces nucléases produisent des cassures double-brin (CDB) de l’ADN spécifique au site, qui peuvent ensuite être réparées par jonction d’extrémités non homologues (JEHN) imprécise et source d’erreurs (modèle de donneur / mutation de point précis) ou par des voies de recombinaison homologue (HDR) (délétion/indels/insertions) entraînant une mutagenèse ciblée. Par conséquent, se développe une population mixte de cellules avec des erreurs d’indels hétérogènes et une variation des fréquences d’édition allélique. Ensuite, on mesure les fréquences d’édition génomique au niveau du locus souhaité. Les lignées cellulaires clonales isolent les cellules individuelles, qui sont ensuite dosées afin de vérifier l’événement d’édition génomique.
Avantages de l’utilisation de la dPCR sur nanoplaques pour la détection de l’édition génomique (CRISPR-Cas9)
- Sensibilité supérieure permettant de détecter les événements d’édition présents à des fréquences de 0,5 %
- Quantification absolue d’événements d’édition dans seulement 5 ng d’ADNg total
- Capacité à faire la distinction entre les modifications homozygotes et hétérozygotes dans les populations clonales
Quantification de banques NGS
La quantification de banque de séquençage à haut débit est une étape essentielle pour l’utilisation de vos cuves à circulation à pleine efficacité. Des preuves indiquent que la surcharge ou la sous-charge d’une banque NGS à la suite d’une quantification de banque imprécise nuit à la qualité et à la sortie des données. L’utilisation de la PCR digitale pour déterminer la concentration absolue d’un regroupement de banques NGS peut être grandement bénéfique pour l’obtention d’un rendement optimal et la réduction du coût par échantillon.
Avantages de l’utilisation de la PCR digitale par nanoplaques pour la quantification de banques NGS
- Quantification absolue de fragments de banque amplifiable sans biais d’amplification et sans biais standard avec des résultats en 2 heures, peut s’adapter aux tests de routine
- Reproductibilité élevée et uniformité supérieure pour le regroupement de banques avec une couverture de tous les types de banques Illumina avec un dosage
Quantification et interaction des protéines
La technologie de couplage par interactions protéine-protéine (Protein Interaction Coupling, PICO) d’Actome permet au QIAcuity Digital PCR System d’offrir une approche particulièrement polyvalente et sensible afin de détecter et de quantifier les protéines isolées et les interactions protéine-protéine. La technologie PICO traduit le statut de protéines complexes en codes-barres d’ADN qui peuvent être amplifiés et détectés à l’aide de la dPCR. C’est particulièrement utile pour examiner des voies cellulaires, rechercher des biomarqueurs protéiques, développer de nouveaux dosages pour la recherche pharmaceutique ou réaliser une analyse multiomique.
Avantages de l’utilisation de la dPCR sur nanoplaques pour la détection des protéines
- La seule technologie sur le marché pour quantifier les protéines à l’aide de la dPCR
- Détection des protéines, des interactions protéine-protéine et des modifications post-translationnelles au niveau unicellulaire
