Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit

Para la purificación automatizada a media escala de proteínas marcadas con 6xHis

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Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit (4)

Cat. No. / ID:  969261

Para 4 x 96 preparaciones de proteína marcadas con 6xHis: 4 QIAfilter 96 Plates, 4 TurboFilter 96 Plates, 1 x 100 ml Ni-NTA Superflow
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El Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit está concebido para su uso en aplicaciones de biología molecular. Este producto no está concebido para el diagnóstico, la prevención ni el tratamiento de enfermedades.

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Features

  • Purificación totalmente automatizada de hasta 2 mg de proteína por pocillo
  • Proteína de alta pureza libre de contaminación cruzada
  • Purificación en condiciones nativas o desnaturalizantes

Product Details

El Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit proporciona una purificación automatizada de hasta 300 µg de proteína recombinante a partir de 96 muestras en paralelo (protocolo normalizado, 5 ml de volumen de cultivo por muestra). Los lisados celulares bacterianos limpios fluyen a una placa de filtro precargada con Ni-NTA Superflow mediante la estación de trabajo BioRobot. Este módulo único de cromatografía de afinidad por quelación de metal de 96 pocillos une con fuerza y selectivamente las proteínas marcadas con His. Los protocolos listos para ejecutar se proporcionan para la purificación en condiciones nativas o desnaturalizantes.

Performance

En respuesta a las necesidades de los clientes’ de mayores cantidades de proteína de procedimientos automatizados, QIAGEN ha adaptado el protocolo Ni-NTA Superflow 96 BioRobot para permitir el proceso de mayores volúmenes de cultivos y la purificación de hasta 2 mg cantidades de proteína marcadas con His por pocillo. El aumento de la cantidad de la resina Ni-NTA Superflow utilizada en el procedimiento de 200 µl por pocillo y una formulación optimizada de tampones de lisis permite procesar hasta 25 ml (purificación en condiciones nativas) o 15 ml (purificación en condiciones desnaturalizantes) de cultivos (protocolos de alto rendimiento). Los cultivos celulares se transmiten a bloques de 24 pocillos para su procesamiento. El aumento correspondiente en la biomasa puede producir un aumento del rendimiento de la proteína pura marcada con His por pocillo (consulte la tabla y la figura  Cantidad de miligramos de proteínas marcadas con His por pocillo), lo que permite que varios ensayos se lleven a cabo en el mismo lote de proteínas y que se reduzca el número total de preparaciones de proteínas requeridas; consulte también la figura  Cribado automatizado de clones de expresión. La purificación en un único paso proporciona proteínas de gran pureza en una amplia gama de rendimientos y se puede realizar la purificación de grandes complejos proteicos.

Rendimientos de proteínas marcadas con His que utilizan el protocolo adaptado Ni-NTA Superflow 96 BioRobot
Proteína marcada con His Rendimiento total por pocillo
(µg)*
Concentración de proteína
(mg/ml)†
Proteína verde fluorescente 4000 6,0
Polimerasa de ARN T7 1000 1,4
GroES 300 0,4
Cloranfenicol acetiltransferasa 2400 4,4
GroEL 740 1,0
Factor de necrosis tumoral α 1600 2,5
GroES/GroEL 1200 1,5
Cpn-10 170 0,3
* Rendimiento obtenido en dos fracciones de elución de 550 µl (promedio de 6 purificaciones independientes). El 80 % de la proteína eluye en los primeros 550 µl.
† Concentración de proteína en la primera fracción de elución de 550 µl.

 

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Principle

El QIAexpress Ni-NTA Protein Purification System, incluyendo el Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit, se basa en la notable selectividad de la resina patentada de Ni-NTA (ácido níquel-nitrilotriacético) para proteínas que contienen un marcador de afinidad de seis o más residuos de histidina: — el marcador His. Esta tecnología permite la purificación en un paso de casi cualquier proteína marcada con His a partir de cualquier sistema de expresión en condiciones nativas o desnaturalizantes. El NTA, que tiene cuatro lugares de quelación para los iones de níquel, une el níquel con mayor fuerza que los sistemas de purificación por quelación de metales que solo tienen tres lugares disponibles para la interacción con iones de metal. El lugar adicional de quelación impide la lixiviación iónica del níquel y da lugar a una mayor capacidad de unión y a preparaciones de proteína con una pureza más elevada que las obtenidas mediante otros sistemas de purificación por quelación de metales. El sistema QIAexpress se puede utilizar para purificar proteínas marcadas con His a partir de cualquier sistema de expresión, incluyendo baculovirus, células de mamíferos, levaduras y bacterias. (Consulte la figura  Purificación de proteína con el sistema de purificación de proteína Ni-NTA).

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Procedure

La purificación de las proteínas marcadas con His se divide en 4 etapas: lisis, unión, lavado y elución celular y es la base del Ni-NTA Superflow BioRobot Kit (consulte  Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit). La purificación de proteínas recombinantes utilizando el sistema QIAexpress no depende de la estructura tridimensional de la proteína o de la etiqueta 6xHis. Esto permite la purificación de proteínas en un paso en condiciones nativas o desnaturalizantes, a partir de soluciones diluidas y lisados sin procesar. Los desnaturalizantes y detergentes fuertes se pueden utilizar para la solubilización y purificación eficientes de los receptores, las proteínas de membrana y las proteínas que forman cuerpos de inclusión. Los reactivos que permiten una eliminación eficiente de contaminantes de unión no específicos se pueden incluir en tampones de lavado (consulte la tabla). Las proteínas purificadas se eluyen en condiciones suaves añadiendo 100-250 mM de imidazol como competidor o por reducción del pH.

El Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit está diseñado para su uso con las estaciones de trabajo BioRobot 3000, 8000 o 9600. .

Reactivos compatibles con la interacción His/Ni-NTA
DesnaturalizantesDetergentesAgentes reductoresOtrosSalesPara almacenamiento a largo plazo
6 M de Gu·HCl2 % de Triton X-10020 mM de ME50 % de glicerol4 M de MgCl2Hasta un 30 % de etanol
8 M de urea2 % de Tween 2010 mM de DTT20 % de etanol5 mM de CaCl2o 100 mM de NaOH
 1 % de CHAPS20 mM de TCEP20 mM de imidazol2 M de NaCl 

 

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Applications

El QIAexpress Ni-NTA Protein Purification System proporciona una purificación fiable en un paso de proteínas adecuadas para muchas aplicaciones, entre las que se incluyen:

  • Investigaciones estructurales y funcionales
  • Cristalización para la determinación de la estructura tridimensional
  • Ensayos relacionados con interacciones proteína-proteína y proteína-ADN
  • Inmunización para producir anticuerpos

Supporting data and figures

Specifications

FeaturesSpecifications
ApplicationsProteómica
Yield15 µg – 4 mg
Start materialLisado celular
TagEtiqueta 6xHis
Bead size60-160 µm
Special featureSin contaminación cruzada
ScaleEscala media
Number of preps per run1-96 muestras por serie
ProcessingAutomatizado
Support/matrixSuperflow
Binding capacity5-20 mg/ml

Resources

Safety Data Sheets (1)
Kit Handbooks (2)
For Automated medium and large-scale purification of 6xHis-tagged proteins
Supplementary Protocols (2)
The two protocols given below are for the use of the Ni-NTA Superflow 96 BioRobot® Kit in manual procedures. The kit has been specially designed and optimized for automated 6xHis-tagged protein purification on QIAGEN® BioRobot Systems. For more details of the advantages of BioRobot Systems see the Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit Handbook supplied with the kit or contact one of the QIAGEN Technical Service Departments or local distributors listed on the last page of the handbook.
The following protocols have been designed for the use of Ni-NTA Superflow Columns on the QIAvac 6S vacuum manifold or in gravity-flow applications on the QIArack. Up to 15 mg 6xHistagged protein can be purified per column from cleared lysate derived from up to 1 liter of (E. coli) bacterial culture.
Certificates of Analysis (1)

FAQ

What are your recommendations for PCR template preparation for use with the EasyXpress Insect Kit II?

We recommend to use the EasyXpress Linear Template Kit Plus to generate PCR products optimized for use in protein expression with the EasyXpress Insect Kit II.

This kit uses specially designed primers to amplify coding DNA sequence and supplement it with regulatory elements required for optimal transcription and translation in cell-free expression systems. In addition, specially designed 5' untranslated regions (UTRs) on the sense adapter primer sequences reduce the formation of secondary structure in the translation initiation region, one of the commonest causes of low expression rates. A His-or Strep-tag II can be added to either terminus, greatly simplifying protein purification and detection after expression.

FAQ ID -1221
What are the features and benefits of the QIAexpress 6xHis Tag System?

FEATURES BENEFITS
The interaction of the 6xHis tag with Ni-NTA matrices is conformation independent One-step purification can be carried out under native or denaturing conditions
Mild elution conditions can be used Binding, washing, and elution are highly reproducible, and have no effect on protein structure. Pure protein products are ready for direct use in downstream applications
The 6xHis tag is much smaller than other commonly used tags 6xHis tags can be used in any expression system. The Tag does not interfere with the structure and function of the recombinant protein
The 6xHis tag is uncharged at physiological pH The 6xHis tag does not interfere with secretion
The 6xHis tag is poorly immunogenic The recombinant protein can be used without prior removal of the tag as an antigen to generate antibodies against the protein of interest
Using Factor Xa Protease, 6xHis tag can be easily and efficiently removed The detagged protein can be used for crystallographical or NMR studies where removal of the 6xHis tag may be preferred
Some QIAexpress vectors feature a 6xHis-dihydrofolate reductase tag (6xHis-DHFR tag) Small peptides fused to the 6xHis DHFR tag are stabilized while being expressed. The 6xHis-DHFR tag is not highly immunogenic in mouse and rat, so that peptides fused to the tag can be used directly for immunizations or epitope mapping

 

FAQ ID -193
Can Ni-NTA resins be used to purify protein with an internal His-tag?
Yes, Ni-NTA Agarose and Superflow will bind a 6xHis-tag whether it is located internally or at the C- or N-teminal end of the protein. Note that the His-tag must be exposed for binding at the surface of the protein to allow for efficient purification under native conditions.
FAQ ID -496
Do you have a protocol for manual purification of 6xHis-tagged proteins expressed in E. coli using Ni-NTA Superflow?