miRCURY LNA miRNA Custom Probe PCR Assays

• Einfaches Design eines individuellen Assays für Ihre spezifische miRNA von Interesse
• Detektiert echte Signale in einem sehr niedrigen Nachweisbereich bereits ab 1 miRNA-Kopie
• Schneller und einfacher 2-stündiger Workflow
• miRNA-Assay-Design für jede neuartige miRNA, miRNA-Isoform oder -Variante

miRCURY LNA miRNA Custom Probe PCR Assays sind individuell designte miRNA-PCR-Primersets, die eine extrem sensitive und spezifische miRNA-Quantifizierung mit dem miRCURY LNA miRNA Probe PCR System erlauben. Sowohl der PCR-Amplifikations-Vorwärts-Primer als auch die FAM- und Dark-Quencher-markierte Sonde sind miRNA-spezifisch und mit LNA-Technologie optimiert und erhöhen so die Assay-Leistung. Assays können einfach online mit demselben robusten und optimierten Algorithmus wie unsere vorgefertigten Assays erstellt werden. Somit können benutzerdefinierte und vorgefertigte Assays kombiniert werden und funktionieren garantiert.

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Hoch sensitiver Nachweis von echten Signalen

Die außergewöhnliche Sensitivität der miRCURY LNA miRNA Custom Probe PCR Assays wird durch die Kombination von universeller reverser Transkription mit LNA-optimierten, T_m-normalisierten miRNA-spezifischen Primern und Sonden erzielt. Diese Kombination ermöglicht eine genaue und zuverlässige Quantifizierung einzelner miRNAs schon aus 1 pg Gesamt-RNA bzw. 1 Molekül, ohne dass eine Präamplifikation erforderlich ist (siehe  Genaue Quantifizierung selbst bei wenig Ausgangsmaterial und  Außergewöhnliche Effizienz über einen großen dynamischen Bereich hinweg). Die Sensitivität und der schnelle Workflow machen das System besonders gut geeignet für Serum- und Plasmaproben. Dank der QuantiNova-Enzyme werden auf Anhieb hoch reproduzierbare Ergebnisse zwischen technischen und biologischen Replikaten erzielt, was Probenmaterial und Zeit spart.

Im Vergleich mit anderen miRNA-sondenbasierten PCR-Systemen, die darauf beruhen, dass nur die Sonde Spezifität generiert, sind sowohl Primer als auch Sonde der miRCURY LNA miRNA Custom Probe Assays miRNA-spezifisch und kurz genug, um beim Binden an das Ziel nicht zu überlappen (siehe  Überblick über das miRCURY LNA miRNA Probe PCR System), wodurch sich die Sensitivität, Spezifität und Effizienz des Assays erhöhen. In Verbindung mit einem ausgezeichneten Signal-Rausch-Verhältnis (siehe  Genaue Detektion selbst bei hohem RNA-Hintergrund) ermöglicht diese einzigartige Eigenschaft die Unterscheidung von eng verwandten miRNAs selbst bei Sequenzunterschieden von nur einem Nukleotid (siehe  Trennschärfe von nur einem Nukleotid Unterschied).

Validiert und optimiert

Assay-Designs (Primer und Sonde) für neuartige miRNAs beruhen auf einem Design-Algorithmus, der von LNA- und Assay-Experten erstellt wurde. Dieser umfassende Algorithmus evaluiert und optimiert 60 Parameter, die in silico mit den strengsten Leistungskriterien validiert werden, um zu gewährleisten, dass das Design die höchste Sensitivität und Spezifität bietet. Das Ergebnis sind Assays, die eine Detektion schon von 1 miRNA-Kopie ermöglichen.

Schnell und einfach

Das benutzerfreundliche, 2-stündige Protokoll spart Zeit und Arbeit. Durch die Verwendung einer universellen Transkription sowie optimierter RT-PCR-Protokolle wird das Verfahren im Vergleich zu anderen Lösungen wesentlich vereinfacht. Darüber hinaus kann die im RT-Schritt generierte cDNA über das gesamte miRCURY LNA miRNA Probe PCR System hinweg verwendet werden. Damit können Sie je nach den Anforderungen Ihrer Forschung nahtlos von Panels zu Assays übergehen und Probenmaterial und Zeit sparen. Die Anzahl der Pipettierschritte und damit die technische Variation werden auf ein Minimum reduziert. Die Robustheit des Assays ermöglicht ein Setup bei Raumtemperatur sowie verzögerte Läufe für mehr Flexibilität und den Einsatz in der Automatisierung Dieser vereinfachte Workflow ermöglicht in Verbindung mit der ISO-konformen Assay-Herstellung eine äußerst hohe Reproduzierbarkeit von Tag zu Tag sowie von Standort zu Standort.

Der Design-Prozess

Mit dem miRCURY LNA miRNA Custom Probe PCR Assay Design Tool können Sie leicht hoch sensitive und spezifische LNA-optimierte PCR-Primersets und Sonden für jede miRNA designen, für die kein vorgefertigtes Assay verfügbar ist. Der innovative Algorithmus wertet etwa 3.000 Primerpaare und Sonden-Designs auf der Grundlage von mehr als 60 verschiedenen Kriterien aus, um innerhalb weniger Minuten die optimalen LNA-Primer und -Sonden für Ihre miRNA zu finden. Das Tool wurde für miRNAs entwickelt, kann aber auch für andere kleine RNAs mit 14- 27 Nukleotiden Länge verwendet werden.

Die Design-Kriterien umfassen:

• Optimierung der Schmelztemperaturen durch Variation der LNA-Verteilung in Primern und Sonde, um eine hohe Amplifikationseffizienz und -spezifität zu gewährleisten.
• Berechnungen und Anpassungen von Selbst- und Kreuzhybridisierungswerten für effiziente PCR-Reaktionen.
• Anpassungen zur Vermeidung der Bildung potenzieller Primer–Dimere in der PCR-Reaktion.
• Intelligente Positionierung von LNA-Basen in Primern und Sonde basierend auf unserem umfangreichen Wissen über das Design von LNA-Oligonukleotiden.
• miRBase-Suchabfragen zur Identifizierung potenzieller miRNAs mit hoher Sequenzähnlichkeit innerhalb der gleichen Spezies. Dies gewährleistet, dass die Primersets und Sonden hochspezifisch für die kleine RNA sind, für die sie entwickelt wurden.

Ein einzigartiges System für die miRNA-Quantifizierung

Das miRCURY LNA miRNA Probe PCR System ermöglicht die sensitive, spezifische miRNA-Quantifizierung und -Profilerstellung durch Real-time PCR. Die Detektion beruht auf einer FAM- und Dark-Quencher-markierten Hydrolysesonde. Das System deckt alle Schritte ab, die für die Umwandlung von miRNA in cDNA und für den anschließenden qPCR-Nachweis von miRNAs erforderlich sind. Die miRCURY LNA miRNA Custom Probe PCR Assays wurden mit dem QuantiNova Probe Master Mix validiert; die Verwendung anderer Reagenzien für die qPCR beeinflusst die Ergebnisse.

RNA Spike-In Kit für RT

Das RNA Spike-In Kit dient zur Qualitätskontrolle der Schritte zur RNA-Isolierung, cDNA-Synthese und PCR-Amplifikation in miRCURY LNA miRNA Probe PCR Experimenten, damit Sie Proben schlechter Qualität frühzeitig identifizieren und Zeit und Reagenzien sparen können. Das Kit enthält einen UniSp2, UniSp4 und UniSp5 RNA Spike-in Template Mix und das cel-miR-39-3p RNA Spike-in Template.

miRCURY LNA RT Kit

Ein universelles Reverse-Transkription-Kit für zwei Nachweissysteme. Das miRCURY LNA RT Kit wird sowohl für das miRCURY LNA miRNA PCR System, das für den Nachweis SYBR Green verwendet, als auch für das sondenbasierte miRCURY LNA miRNA Probe PCR System eingesetzt. Das Kit enthält zwei systemspezifische Reaktionspuffer sowie alle Reagenzien, die zur schnellen und bequemen Durchführung von miRNA-Polyadenylierung und reverser Transkription in einem Reaktionsschritt erforderlich sind.

miRCURY Probe PCR Kit

Das speziell für das miRCURY LNA miRNA Probe PCR System optimierte Kit enthält den leistungsstarken QuantiNova Probe Master Mix und den miRCURY Probe Universal Reverse Primer. In Verbindung mit einem miRCURY LNA miRNA Probe Assay oder einem miRCURY LNA miRNA Probe PCR Panel ermöglicht die Chemie den miRNA-Nachweis durch quantitative Real-time PCR.

miRCURY LNA miRNA Probe Assays

Diese Primer- und Sonden-Assays verwenden miRNA-spezifische Hydrolysesonden und miRNA-spezifische Vorwärts-Primer, die dazu konzipiert sind, anhand der aktuellsten Sequenzinformationen in der miRBase 22 reife miRNAs nachzuweisen. Der miRCURY Probe Universal Reverse Primer ist im miRCURY Probe PCR Kit enthalten.

miRCURY LNA miRNA Probe PCR Panels

Gebrauchsfertige, vorgefertigte PCR-Panel-Platten für den Einmalgebrauch für die schnelle Profilerstellung reifer miRNAs mit Fokus auf das miRNome, spezifische Signalwege, bestimmte Probentypen wie Serum/Plasma oder in einem benutzerdefinierten Panel.

GeneGlobe Data Analysis Center

Dieses kostenlose, webbasierte Analysetool führt Sie mit Hilfe eines einfachen Assistenten Schritt für Schritt durch die Normalisierung und Analyse Ihrer Daten und erstellt publikationsreife Abbildungen.

Der erste Schritt, die reverse Transkriptionsreaktion, ist eine einfach durchführbare Einzelröhrchen-Reaktion. Gesamt-RNA, einschließlich miRNA, wird als Ausgangsmaterial eingesetzt, und die resultierende cDNA wird bei der Real-time-PCR-Amplifikation mit LNA-optimierten Primern und Hydrolysesonde für den Nachweis der reifen miRNAs verwendet. Dies ermöglicht eine unkomplizierte miRNA-Quantifizierung und -Profilierung, die für jedes Labor mit einem Realtime-PCR-Cycler zugänglich ist.

Als Bestandteil des miRCURY LNA miRNA Probe PCR System werden miRCURY LNA miRNA Custom Probe Assays für folgende Applikationen verwendet:

• miRNA-Expressionsnachweis, -Profilierung und -Quantifizierung
• Entwicklung von miRNA-Biomarkern – Screening und Identifizierung
• Analyse von miRNA-Regulation und -Signalwegen
• miRNA-Nachweis in komplexen Probentypen und Proben mit niedrigem miRNA-Expressionsniveau (z. B. Exosomen, Serum, Plasma, Urin, FFPE-Schnitte)
• snoRNA-Nachweis
• Validierung der miRNA-Sequenzierung