QIAcuity Residual DNA Quantification Kits

Zur Überprüfung auf Verschleppung von Wirtszell-DNA mit höherer Genauigkeit und Präzision unter Verwendung des QIAcuity Digital PCR Systems

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E. coli resDNA Quant Standard Kit

Cat. No. / ID:  250221

E. coli resDNA Quant Standard (1x), Rehydration Buffer
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996,00 €
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Kit
resDNA Quant Standard
resDNA Quant
Cell type
E. coli
CHO
HEK293
QIAcuity Residual DNA Quantification Kits sind für molekularbiologische Anwendungen vorgesehen. Diese Produkte sind nicht zur Diagnose, Prävention oder Behandlung einer Erkrankung vorgesehen.

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Features

  • Vorgemischter Master-Mix mit Kontrollen für einfachen Reaktionsaufbau und Nachweis von Wirtszell-DNA
  • Ermöglicht den genauen Nachweis von Wirtszell-DNA-Rückständen aus E.coli-, CHO- und HEK293-Zellen bis zu niedrigen Femtogramm-Mengen
  • Ein gezielter Multi-copy-Assay, der stark fragmentierte Wirtszell-DNA nachweist und quantifiziert
  • Ermöglicht den Nachweis von Wirtszell-DNA in extrahierten und nicht extrahierten Proben

Product Details

Die Kontamination mit Wirtszell-DNA in Produkten wie Impfstoffen, Medikamenten und anderen Biopharmazeutika birgt erhebliche Gesundheitsrisiken. Darum unterliegen sichere Grenzwerte einer strengen Regulierung durch Behörden wie die US FDA und die WHO. Klare Richtlinien für die Obergrenzen von Rest-DNA werden basierend auf dem Verabreichungsweg von Medikamenten, der Infektiösität und der Onkogenität der kontaminierenden Zell-DNA festgelegt. Beispielsweise sollte die parenterale Gabe nicht tumorigener Zell-DNA auf 10 ng/Dosis und eine maximale Länge von 200 bp begrenzt werden, während die WHO für die orale Gabe von Impfstoffen weniger als 100 µg Rest-DNA pro Dosis empfiehlt. 


Nachweis und Entfernung derartiger Kontaminationen bei der Arzneimittelherstellung erfordern hochsensitive und genaue Messungen der extrem geringen Mengen spezifischer Wirtszell-DNA in den Arzneimitteln.


Digitale PCR ist die bevorzugte Nachweismethode zur Quantifizierung von Rest-DNA. Grund dafür sind ihre beispiellose Sensitivität und Genauigkeit, insbesondere bei Kontaminationen im Spurenbereich, verglichen mit anderen Nachweismethoden wie qPCR. QIAcuity Residual DNA Quantification Kits ermöglichen den genauen und präzisen Nachweis von Wirtszell-DNA aus Escherichia coli (E. coli), Chinese Hamster Ovary(CHO)-Zellen und Human Embryonic Kidney 293(HEK293)-Zellen.     

 

Performance

Die QIAcuity Residual DNA Quantification Kits liefern genaue Quantifizierungsergebnisse für CHO-, E. coli- und HEK293-Rest-DNA (resDNA) mit oder ohne Extraktion, selbst in Gegenwart von PCR-Kontaminationen oder inhibitorischen Reagenzien. Bei den Assays handelt es sich um gezielte Multi-copy-Assays, die stark fragmentierte Wirtszell-DNA-Rückstände genau bestimmen.

  

Assay Target-Kopienzahl Amplifikatgröße Umrechnungsfaktor Kopien/µl in fg/µl
QIAcuity E.coli resDNA Quant Kit 7 < 200 0,35
QIAcuity CHO resDNA Quant Kit ~ 1 Million, nicht definiert (wiederholtes Element) < 200 0,28
QIAcuity HEK293 resDNA Quant Kit ~ 1 Million, nicht definiert (wiederholtes Element) < 200 1,54

 

Das QIAcuity E.coli resDNA Quant Kit weist geringe Mengen ab 5 fg Rest-DNA in einer Einzel-Reaktion nach

Beladungsmenge je Reaktion (fg/rxn) E.coli-Standard (Kopien/µl) Interne Kontrolle (Kopien/µl)*
50.000 2949,7 99,9
5000 291,6 91,7
500 27,6 91,4
50 2,8 93,2
25 1,46 92,5
5 0,45 90,6
NTC 0 98,9

*100 Kopien/µl für interne Kontrolle erwartet

Die digitale PCR bietet im Vergleich zur qPCR eine höhere Nachweissensitivität bei niedrigeren Template-Einsatzmengen und ermöglicht damit eine robustere Anwendung.

Das QIAcuity CHO resDNA Quant Kit weist geringe Mengen ab 5 fg Rest-DNA in einer Einzel-Reaktion nach

Beladungsmenge je Reaktion (fg/rxn) CHO-Standard (Kopien/µl) Interne Kontrolle (Kopien/µl)*
50.000 4939,3     108,7
5000 508,3     104,9
500 50,2     97,6
50 4,7 99,5
25 2,6 101,3
5 0,6 100,4
NTC 0 104,7

*100 Kopien/µl für interne Kontrolle erwartet

Das QIAcuity HEK293 resDNA Quant Kit weist geringe Mengen ab 5 fg Rest-DNA in einer Einzel-Reaktion nach

Beladungsmenge je Reaktion (fg/rxn) HEK293-Standard (Kopien/µl) Interne Kontrolle (Kopien/µl)*
50.000 1104,9 96,6
5000 104,5 92,5
500 8,83 92,4
50 0,99 94,4
NTC 0 96,2

*100 Kopien/µl für interne Kontrolle erwartet

Die Kits werden zusammen mit dem QIAcuity Digital PCR System und QIAcuity Nanoplates verwendet und ermöglichen einen lückenlosen, schnellen dPCR-Workflow, der mit der qPCR vergleichbar ist, aber eine absolute Quantifizierung der resDNA in Ihrer Probe ermöglicht. Die Kits wurden unter Berücksichtigung der Anforderungen an Bioprozessherstellung und -QK entwickelt.

 

Principle

Das Prinzip der dPCR-Reaktion in den Nanoplatten finden Sie hier beschrieben.

Die Verwendung der digitalen PCR mit QIAcuity zur Überwachung von Wirtszell-DNA verbessert den LOD/LOQ-Wert durch Partitionierung der Bulk-Probe mithilfe der QIAcuity Nanoplate 26k. Die Partitionierung steigert die effektive Konzentration des Targets, sodass eine geringere Menge an Wirtszell-DNA erfasst und mit höherer Genauigkeit und Präzision gemessen werden kann. Die Möglichkeit, hohe Template-Einsatzmengen in die QIAcuity Nanoplate 26k zu laden, in Kombination mit einer erhöhten Anzahl an Partitionen, ist einer der Gründe für die höhere Genauigkeit und Präzision des Nachweises von Wirtszell-Resten.

  

 

Procedure

Das Lysat wird dem Rest-Quantifizierungsassay zusammen mit der internen Kontrolle zugegeben und die Wirtszell-DNA wird mittels absoluter Quantifizierung gemessen. Kopien/µl werden über einen bereitgestellten Umrechnungsfaktor in fg/µl umgerechnet.

Applications

Die QIAcuity Residual DNA Quantification Kits eignen sich ideal zur hochpräzisen Quantifizierung von Wirtszell-DNA in komplexen Zwischenprodukten von Bioverfahren.

Supporting data and figures

FAQ

What does the standard kit contain?
The standard for HEK293, CHO, and E. Coli contains genomic DNA, and we recommend digestion of the standard for better migration out into the partitions.
FAQ ID - 3938
dPCR results are in copies per microliter. How do I calculate host cell DNA contamination in femtogram per microliter?

The conversion factors from copies per microliter to femtogram per microliter for each target assay (E. coli, CHO, and HEK293) will be provided in the quick-start protocol and the QIAcuity User Manual Extension: Application Guide.

FAQ ID - 3876
My samples are highly fragmented. Is the dPCR result for resDNA quantification accurate?

ResDNA Quant Kit (E. coli, CHO, and HEK293) assays are multicopy target assays that ensure quantification of  resDNA unaffected by the fragmentation level. In addition, short amplicon regions are selected for each target region. 

FAQ ID - 3877
Is DNA extraction from the samples needed?

No. DNA extraction is not required. However, if the samples contain high levels of PCR inhibitors or high protein concentration, DNA extraction is recommended for accurate quantification of ResDNA contamination.

FAQ ID - 3873
What is the amount of standard for the different kit?
The standard that is provided has an amount of 1000 pg that will be diluted with 100 µL of rehydration buffer down to working solution of 10 pg/µL.
FAQ ID - 3936
Is restriction enzyme digestion required?

Restriction digestion of the templates is required when the template length exceeds 20 kb for a better distribution of templates within partitions. Recommended restriction enzymes can be found in the applications guide and quick-start protocols.

FAQ ID - 3875
Which extraction kits are recommended?

QIAamp UCP DNA Micro Kits, QIAamp HMW MagAttract Kits, QIAsymhony DSP Kits, QIAsymphony Certal Kits, and DNeasy Blood & Tissue Kits are few recommended extraction kits to combine with ResDNA Quant Kit.

FAQ ID - 3874
What is the preferred storage temperature for reconstituted assay for the QIAcuity HEK293 resDNA Quant Kit (96)?
The recommended storage temperature is 4°C for 72 hours.
FAQ ID - 3935
Is dPCR sensitive to inhibition?

dPCR is less prone to inhibition in comparison to qPCR; however, we recommend dilution of samples that are known to contain PCR inhibitors.

FAQ ID - 3880
How much sample can I load for detecting host cell contamination?

26k Nanoplates are recommended for resDNA quantification, which maximizes the amount of template that can be loaded within a single reaction. In 26k nanoplates, this corresponds to 28 μl in 40 μl reaction volume. In addition, maximum template loading amounts for each kit will be provided in QSPs. 

FAQ ID - 3879
What are the ResDNA Quant Kit components?

The kits are composed of a premixed master mix for CHO and E. coli in liquid format that contains the target. For HEK293 the same composition comes in lyophilized format. The kit also contains an internal control assay detected in Green and Yellow channel, internal control DNA, positive control DNA, and dPCR qualified water. All necessary components are included in the ResDNA Quant Kits.

FAQ ID - 3878
How long can I store the reconsituted assay regarding QIAcuity HEK293 resDNA Quant Kit (96) at 4°C?
For optimal performance, the recommendation is to use the reconstituted assay within 72 hours.
FAQ ID - 3934
What region is targeted in the QIAcuity E. coli resDNA Quant Kit (96)?
The QIAcuity E. coli resDNA Quant Kit (96) is targeting the transcribed genomic regeion of 16S with <200 bp fragment size. 
FAQ ID - 3939
How did you calculate the conversion factor?
A serial dilutions of HEK293, CHO, and E. Coli gDNA standard test them using HEK293, CHO, and E. Coli ResDNA Quant Kits, respectively. We then compare the copies per microliter obtained at different loading concentrations. We correlate the number of copies of target amplicon with the loading amount in picogram. To rule out any issues with PCR performance, loss of target amplicons, loading errors, user error, instrument errors, etc. skewing the true conversion factor, we repeat the testing over multiple samples, multiple batches of kits, standards, and multiple users. This gives us our accurate conversion factor.
FAQ ID - 3937