dPCR 初学者指南

第 1 步：制备和加载

作为第一步，准备好您的样本很重要。我们建议测定 DNA 的含量与纯度。根据您的应用，也可在不同稀释倍数下测定样本。最好使用不含较多 PCR 抑制剂的纯样本。有关样本制备的更多信息，请参阅 QIAcuity Applications Guide。

接下来，在 QIAcuity Software Suite 中创建一个实验，设定 dPCR 参数——启动、循环和图像配置，反应混合物，样本与对照以及孔板布局。一旦定义了孔板，就可以开始运行了。在一个预孔板中制备反应混合物：将QIAcuityPCR 预混液与样本、引物、无 Rnase 水及可选的限制酶混合在一起。最终的反应体积取决于采用的 QIAcuity 纳米微孔板。然后，将制备好的反应混合物转移至纳米微孔板中。为了防止挥发和污染，应以正确的方式密封纳米微孔板。使用封板滚轮将封膜固定到孔板的宏观结构上。使用手动滚轮对孔板密封膜进行牢固的固定对于获得良好的灌注结果很重要。请务必握持孔板的侧缘或使用托盘，平滑地将孔板运送至 QIAcuity，防止晃动或转动，以确保反应混合物位于输入孔的底部。当仪器与 Suite 软件连接时，所有模块将均可供使用，您可加载孔板并开始运行。

第 2 步：运行设置和扩增

孔板加载后，仪器将以蓝色突出显示相关槽位并扫描条形码。以前在 Control Software 中设置的首选实验将链接至定义的孔板及启动、循环和图像配置，并启动运行。

首先，将在启动/滚动模块中处理孔板。在该步骤中，每个孔中的反应混合物被微分化成成千上万个很小的单个反应单元。随后，在一个循环仪中执行 PCR。在一个或另一个分区内的合适模板材料将导致在成像过程中检测到的阳性荧光信号。图像将被发送至 QIAcuity Software Suite 以供进行图像处理。

当前孔板状态可在仪器屏幕或 Software Suite 中查看。

第 3 步：分析结果

要开始分析，请从以下选项中选出一项：绝对定量，突变检测，基因组编辑，拷贝数变异或基因表达。对于绝对定量分析，请选择首选孔和靶标或检测通道。列表视图可显示浓度、置信区间以及有效的阳性和阴性反应分区。热图视图可并列显示靶标通道和参比通道。使用直方图、一维散点图或二维散点图来改变阈值设置。点击重新计算获取基于修改后阈值而计算出的结果。