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REPLI-g WTA Single Cell Kit (24)
Cat. No. / ID: 150063
REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for 24 x 60 µl whole transcriptome amplification reactions (typical yield: 20 µg)
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REPLI-g WTA Single Cell Kit 旨在用于分子生物学应用。该产品不能用于疾病诊断、预防和治疗。
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Features
- 从单一细胞实现完整的转录本覆盖度
- MDA技术可实现均一的WTA，序列偏差可以忽略不计
- 针对新技术应用（包括NGS）优化
- 总RNA或富集mRNA（ploy A +）RNA的扩增
- 用于癌症和干细胞研究的新工具
Product Details
REPLI-g WTA Single Cell Kit能够在单细胞转录本水平上对转录调控的影响进行可靠的研究，并允许从单细胞（1–1000个细胞）进行所有转录物的均一扩增。专用的缓冲液和试剂经过了独特的、可控的净化步骤以防止REPLI-g技术扩增污染的核酸。创新的裂解液可以有效地稳定细胞RNA，以确保所得到的RNA准确地反映体内基因的表达图谱。所有的酶促步骤已经过专门改进，使得用于cDNA准确扩增的RNA得到高效处理。而扩增步骤则采用创新的多重置换扩增（MDA）技术，序列偏差可以忽略不计。
Performance
覆盖全转录组，实验可重复性高
REPLI-g WTA Single Cell Kit包含新颖的REPLI-g SensiPhi DNA聚合酶，以及从1–1000个细胞或等量的小量样本进行全转录本扩增（WTA）的优化缓冲液和试剂。高效裂解细胞、彻底清除基因组DNA（gDNA）和敏感的逆转录物之后，采用多重置换扩增（MDA）技术，以可以忽略的序列偏差对整个转录本均一地扩增cDNA（参见 Multiple Displacement Amplification (MDA) technology）。使用REPLI-g WTA Single Cell Kit扩增的cDNA，经证明在二代测序技术（NGS）和real-time PCR应用中具有各细胞间和各次实验间的高度可重复性（参见 High level of experimental reproducibility）。扩增的cDNA可以轻松地应用于各种下游应用（参见 REPLI-g amplified cDNA performs like gDNA in downstream experiments）。蛋白编码RNA的数量多
扩增富集mRNA的RNA (poly A+)的能力，使REPLI-g WTA Single Cell Kit特别适用于通过NGS研究单细胞转录本水平上的转录调控影响。产生超过90％的NGS片段的核糖体RNA（rRNA）扩增几乎完全被消除，可产生有意义的mRNA-Seq数据。使用mRNA富集实验方法的WTA后，80％以上的读段可以用于定位蛋白编码RNA（参见 High number of mappable reads from just 3 cells）。可靠检测低丰度转录本
单细胞分析的挑战性大，尤其是同一细胞内的转录本丰度差异很大时。为获得准确的结果，应确保全转录组扩增时可靠扩增所有转录本。REPLI-g WTA Single Cell Kit高度适合于但细胞中转录本分析，即便是低丰度转录本。对使用REPLI-g技术扩增的转录本abl-1进行real-time PCR分析，结果显示即便是低丰度转录本也能在使用该试剂盒扩增后，得以可靠的检测（参见 Reliable detection of even low-abundance transcripts from single cells）。多种研究领域的应用
REPLI-g WTA Single Cell Kit可以从单细胞（如肿瘤细胞、干细胞或分选细胞）有效地扩增获得cDNA，并从纯化的总RNA或poly A+ RNA（10 pg–100 ng）生成和扩增cDNA，适合于广泛的研究领域（参见下表）。| 样本材料（细胞/总RNA） | 研究领域 |
|---|---|
| 人类/动物 | 生物标记物的研究（表达） |
| 干细胞研究 | |
| 游离胚胎细胞分析 | |
| 嵌合体研究 | |
| 遗传易感性研究 | |
| 转基因动物基因分型 | |
| 癌症 | 体细胞遗传变异分析 |
| 肿瘤恶化 | |
| 肿瘤干细胞/演化 | |
| 游离肿瘤细胞分析 |
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Principle
转录调节受到各种因素驱动，如应激、细胞环境或由疾病或体细胞基因组变异（例如，点突变、拷贝数变异或结构变化）等。此外，如可变剪接等转录后加工，导致转录模式不同并最终造成生理机能的不同。由于组织的复合结构，在单细胞中对转录调控进行研究，而不是分析大量的细胞并且立足分析结果解释他们的行为，正不断引起科学家们的兴趣。
REPLI-g WTA Single Cell Kit经过特别设计，能在单细胞转录水平上可靠地研究转录调节的影响。它可以对整个转录本进行高度均一的扩增，并且序列偏差可以忽略不计。REPLI‑g WTA Single Cell Kit提供的单细胞全转录本扩增是对全基因组扩增试剂（REPLI-g Single Cell Kit）的相应补充。本方法基于MDA技术，该技术利用能够复制可达70 kb而无需解离cDNA模板的一种独特的、连续性DNA聚合酶进行cDNA恒温扩增（参见 Multiple Displacement Amplification (MDA) technology）。
REPLI-g WTA Single Cell Kit经过特别设计，能在单细胞转录水平上可靠地研究转录调节的影响。它可以对整个转录本进行高度均一的扩增，并且序列偏差可以忽略不计。REPLI‑g WTA Single Cell Kit提供的单细胞全转录本扩增是对全基因组扩增试剂（REPLI-g Single Cell Kit）的相应补充。本方法基于MDA技术，该技术利用能够复制可达70 kb而无需解离cDNA模板的一种独特的、连续性DNA聚合酶进行cDNA恒温扩增（参见 Multiple Displacement Amplification (MDA) technology）。
REPLI-g WTA Single Cell Kit独特的构成
- 所有的试剂酶和扩增组分都经过了独特的、可控的净化步骤以确保消除被REPLI-g方法扩增的DNA或RNA污染。下面的步骤则是对试剂进行严格的质量控制，以确保其具有完整的功能。
- 独特的裂解缓冲液可以有效地稳定细胞RNA和DNA。这确保了所产生的RNA能准确地反映体内基因表达图谱，以及RNA和DNA保持完整无缺，用于随后的基因组覆盖范围最大化分析。
- 所有的酶促步骤已经过专门改进，使RNA或DNA的扩增准确而有效。例如，这些步骤包括在用于RNA扩增的cDNA合成之前有效的去除gDNA以及确保DNA有效扩增的酶解DNA制备。
- 新颖的REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase可以用于多重置换扩增（MDA）。它是新开发的高亲和力酶，可以更有效地结合DNA，特别是当DNA浓度在反应混合物中较低时。此外，对比基于PCR的方法，REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase具有较强的校对活性，可以将错误减少1000倍。它还具有很强的链置换活性，通过稳定的发夹结构使DNA得以复制，该结构对以Taq酶为基础的全基因组和全转录扩增步骤具有抗性。
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Procedure
基因分析往往需要大量的cDNA。全转录本扩增克服了RNA数量少的限制，可以对小数量的细胞甚至单个细胞进行分析。最简单的反应设置，最简单的反应设置，合理而简单的处理步骤，处理时间只需20分钟，完整的gDNA和RNA平行扩增总反应时间只有4小时，这使得REPLI-g Cell WGA & WTA Kit的操作步骤变得简单和可靠。
REPLI-g Cell WGA & WTA Kit包含用于以下反应的试剂（参见 REPLI-g WTA Single Cell Kit procedure）：
REPLI-g Cell WGA & WTA Kit包含用于以下反应的试剂（参见 REPLI-g WTA Single Cell Kit procedure）：
- 细胞裂解：单一细胞样品（含有1-1000个细胞）在5分钟内有效地裂解，对RNA的完整性没有影响。裂解的样品用于总RNA的WTA，或可选的，富集mRNA（poly A+）RNA。
- cDNA生产：细胞裂解后，在进行WTA前将gDNA去除，这是由于转录水平的精确测量依赖于消除gDNA污染所造成的假阳性结果。根据随后的逆转录反应过程中所选择的底物，所有的转录物（如果采用随机引物和寡核苷酸dT引物进行总RNA富集）或只有多聚腺苷酸转录物（如果采用随机引物和寡核苷酸dT引物进行poly A+ 富集mRNA）将会被扩增。因此，该反应将包含一个随机引物和寡核苷酸dT引物的混合物或只有寡核苷酸dT引物，这就减少了rRNA的扩增，并确保cDNA的3'末端反转录（转录物的大小大约是700–1000bp）。
- 连接反应：合成的cDNA通过一个高效率的连接反应进行连接。由于该连接反应的性质，cDNA片段并未按照它们原本存在于细胞中的顺序组装。然而，这并不影响核酸序列的检测，如剪接区域，在下游应用中的进行NGS或qPCR。
- 全转录本扩增：连接的cDNA随后被扩增，利用MDA技术与新颖REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase，等温反应2小时。
- “从单细胞扩增mRNA（poly A+）3'端区域”实验方案只扩增带有poly A +尾巴的mRNA（和其他的RNA），适合于广泛的应用，包括NGS(RNA-Seq）、real-time PCR和微阵列分析。
- “从单细胞扩增总RNA”实验方案可扩增完整的转录本，包括带有和不带有poly A +尾的RNA，lnc RNA和linc RNA。需要注意的是，rRNA也将扩增并且扩增程度很高。如果用序列特异性探针（例如用qPCR或阵列协同工作），扩增的rRNA并不会影响下游应用的结果。如果将扩增的RNA用于RNA-Seq，请注意超过90％的片段来自于rRNA，因此进行全转录本测序时必须获得充足的读段。
- “纯化RNA的扩增”实验方案针对从总RNA或富集RNA模板进行全转录本扩增的情况而优化，非常适合于大规模应用，包括NGS、real-time PCR和微阵列分析。
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Applications
REPLI-g WTA Single Cell Kit可以从非常小量的样本均一地扩增全部的转录物，以非常有限或甚至可忽略地偏差扩增，准确呈递单细胞的转录模式。根据实验方法，扩增的cDNA非常适用于二代测序（RNA-Seq）、基因表达芯片或qPCR应用。
REPLI-g WTA Single Cell Kit可用于全转录本扩增的分析：
- 带poly A+尾巴的mRNA
- 总RNA
- RNA转录组的所有区域
- mRNA的3'末端
- Lnc和Linc RNA
其不适合用于与小量核酸等一起使用：
- tRNA和miRNA
Supporting data and figures
High number of mappable reads from just 3 cells.
REPLI-g WTA Single Cell reactions were performed on 3–1000 cells in various replicates, using the mRNA (poly A+) enrichment protocol to reduce rRNA amplification. WTA amplified cDNA was fragmented (Covaris S220) and an NGS sequencing library was prepared using the GeneRead Library Prep I Kit (QIAGEN). Sequencing was done on a MiSeq Instrument (Illumina) and RNA biotypes were mapped using Bowtie2. Results demonstrate that the majority of reads (>80%) are mappable to protein coding RNA and Linc RNAs, and that a negligible number of reads map to other, non-targeted RNA biotypes (data for minor RNA biotypes not shown). Comparable results between values obtained after the sequencing of all WTA samples (Mean value [all cells]) and 3-cell WTA samples (Mean value [3 cells]) were obtained.
Resources
补充实验方案 (3)
安全数据表 (1)
学术海报 (2)
快速启动实验方案 (1)
试剂盒操作手册 (1)
Safety Data Sheets (2)
Certificates of Analysis (1)
Kit Handbooks (1)
Scientific Posters (2)
Supplementary Protocols (3)
Quick-Start Protocols (1)
FAQ
Is it possible to use the REPLI-g WTA Single Cell kit to amplify miRNA?
Do you have data to show lowest dropout rate with Repli-G WTA Single Cells kit?