Fabienne Desmots-Loyer
高通量测序

通过强大的 RNA 测序解决方案加速转录组解析

RNA 测序原理解析

RNA 测序 (RNA-seq) 是一种高灵敏度、高精度的下一代测序 (Next-Generation Sequencing, NGS) 技术，是新型转录组学和基因表达研究发现的推动力。由于可捕获生物样本中的全套 RNA 转录物，因此 RNA-seq 可实现：

  • 更大的基因表达分析动态范围
  • 更高的低丰度转录物检测特异性
  • 对癌症基因组学、免疫学、微生物组研究及药物开发至关重要的新型同种型发现

RNA 测序工作流程始于从细胞或组织中提取 RNA，随后进行文库制备：将 RNA 转化为 cDNA，经片段化处理后与测序接头连接。制备完成的 RNA-seq 文库经测序生成数以百万计的读长，然后利用生物信息学工具分析这些读长来揭示转录组的深度信息。

面临 RNA 降解或低起始量样本挑战？通过 QIAseq RNA-seq 解决方案最大限度提升您的 RNA-seq 性能。这些解决方案专为攻克转录组复杂性而设计，例如它们能够改善位于靶向区域的基因表达读长或提高低质量或 FFPE 样本的检测灵敏度，同时节省时间和精力。

用于 RNA-seq 的 RNA 提取

可从包括全血、粪便/微生物组、培养细胞以及新鲜、冷冻或 FFPE 组织在内的各种来源提取 RNA。培养细胞通常能获得高质量、均质的 RNA，但最佳样本类型取决于生物学问题；例如小型肿瘤活检样本可能存在异质性且起始量低。

RNA 质量在很大程度上反映了起始材料的质量和处理方式–新鲜材料最为理想，但立即进行稳定处理和适当储存也至关重要，尽量减少冻融循环次数同样关键。 

典型步骤包括样本稳定处理、破碎和均质化、RNA 纯化、浓缩以及用于定量和完整性评估的 QC。

mRNA 富集和 rRNA 去除

总 RNA 中编码或功能性 RNA 通常仅占极小比例；核糖体 RNA (rRNA) 占样本中 RNA 的绝大部分（高达 90%）。为确保获得最高质量的结果，必须在测序前从总 RNA 中去除 rRNA。

这通常通过两种方式实现：特异性地去除 rRNA，或利用 oligo-dT 选择性地富集包含 A 尾的 RNA。rRNA 去除法可同时保留编码 RNA 和非编码 RNA 的信息，而基于 A 尾的富集法仅保留编码 mRNA 的信息。

您的基因表达和转录组学研究灵敏度是否受到高丰度 rRNA 的影响，导致读长浪费和 RNA-seq 成本增加？

使用可去除 95% 以上无用 rRNA 的高效一步式去除法的 QIAseq FastSelect 技术，并从中获益。无论您处理的是哺乳动物、植物、酵母或细菌 RNA 样本，还是高品质、降解或 FFPE RNA 样本，QIAseq FastSelect 都可为您的 RNA-seq 带来重大改变并提供优于 Ribo-Zero、RiboErase 和 RiboMinus的性能。

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QIAseq FastSelect, monitor screen with barchart in a lab

批量 RNA 测序简介

批量 RNA 测序（批量 RNA-seq）是一种转录组分析方法，涉及从细胞群体、组织或活检样本中提取汇总 RNA 并进行测序。

与单细胞 RNA 测序不同，批量 RNA-seq 可测量不同条件或样本的平均基因表达水平，因此特别适用于分析无需单细胞分辨率的复杂组织或大型细胞群体。该方法常用于全面转录组图谱分析、差异基因表达分析、生物标志物研究及功能基因组学研究。

典型的 RNA 测序工作流程包括文库制备（链特异性或非链特异性），先是进行组织和细胞群体的直接 RNA 提取与扩增，随后进行 cDNA 合成及适配体或连接体的添加。进行总 RNA 测序时，可能需要富集 mRNA 或去除核糖体 RNA (rRNA)。 制备好的文库随后在高通量平台上进行测序，从而实现转录组图景的可靠分析。

链特异性（定向）文库制备可保留转录物的极性。只要转录物在相反链上重叠（反义/lncRNA、UTR 重叠），这一点就很重要，因为链特异性数据可将读长分配给正确的基因，并减少“模糊”计数；多项评估显示，与非链特异性数据相比，重叠区域的定量效果更佳。

RNA-seq 文库制备方法

选择合适的 RNA 测序文库制备方法取决于若干因素，包括实验目标、预算以及目标生物体是否具备参考转录组。

本文提及的 QIAseq 文库制备试剂盒可兼容市面上大多数中高通量测序仪。

总 RNA 测序

总 RNA-seq（全转录组 RNA-seq）捕获样本中的所有 RNA 种类（通常大于 75 个碱基，包括 mRNA 和非编码 RNA），并识别与新型药物疗法的生物反应或缺乏反应相关的基因和通路。该技术能精确测量基因和转录物丰度，是在宽动态范围内发现新型转录物和可变剪接事件的理想选择。一些关键应用包括疾病通路的发现、生物标志物鉴定、疾病亚型的分类以及治疗反应的预测与监测。

总 RNA-seq 遵循四个基本步骤：RNA 提取、核糖体 RNA (rRNA) 去除和文库制备、测序及数据分析。

由于总 RNA 文库包含许多重叠的有义/反义和内含子读长，因此采用链特异性文库制备化学技术（例如 dUTP 第二链标记或定向接头连接）可保留每个读长的转录方向，从而能明确分配到正确基因或同种型，并消除重叠转录物带来的歧义。

QIAseq FastSelect RNA Library Kits 利用简单的 <5 小时工作流程，实现低至 1 ng 起始量总 RNA 的完整转录组测序。

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Young male Scientist using micro pipette with DNA

mRNA 测序

man looking at microscope slide

信使 RNA 测序 (mRNA-seq) 通过从总 RNA 中富集多腺苷酸化 RNA，实现对编码转录组的高分辨率分析。由此生成的 RNA-seq 文库具有高丰度的蛋白质编码基因，其他类型 RNA 的含量则较低。如果 RNA 未进行多腺苷酸化，则会出现缺失。对于低起始量或片段化样本（如来自 FFPE 的样本），多腺苷酸化富集所需的样本质量和数量可能具有挑战性。

研究人员可以整合 QIAseq Stranded mRNA Enrichment Kit 等 mRNA 富集试剂盒，并使用 QIAseq FastSelect RNA Library Kits 将 RNA-seq 文库构建的重点放在蛋白质编码 mRNA 上。

该方法可定量基因表达，并检测不同种类间的已知或新同种型、基因融合及等位基因特异性表达。该方法可通过揭示转录物层级的生物标志物，阐明疾病机制，并指导药物开发、患者分层和安全性评估。

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3’ RNA 测序

3' RNA 测序 (3′ RNA-seq) 主要针对每个转录物的多腺苷酸化尾部进行测序，但传统工作流程难以应对 rRNA 残留、片段化或低起始量 RNA 以及复杂的多步骤方案。

QIAseq FastSelect RNA Library Kits 将 3′ RNA-seq 转变为单管一日工作流程，哪怕是从低起始量或 FFPE 样本中也能获得不含 rRNA 的链特异性文库。它能降低测序成本（每样本≈ 1–500 万读长），同时还支持高通量多重测序（多达 768 个样本）和准确的基因水平表达定量。    

主要应用包括：

  • 大规模差异表达研究，如药物筛选、人群队列分析、生物标志物发现
  • 主要问题在于哪些基因上调或下调的成本敏感型项目
  • 需同时分析数百份样本的临床/转化研究
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miRNA 测序

QIAseq miRNA Library Kits

miRNA 测序 (miRNA-seq) 是一种靶向 RNA-seq 方法，用于分析小型调节 RNA（如微 RNA，即 miRNA）的表达谱。这些分子在基因调控中发挥核心作用，且日益成为疾病研究的重要对象。准确结果取决于经过优化的文库制备和分析工作流程。在处理生物流体样本时，低 RNA 起始量和高抑制剂水平可能带来挑战。兼容低至 1 ng 总 RNA 无需切胶的 miRNA-seq 解决方案有助于克服这些问题，并支持对差异 miRNA 表达进行可靠的检测。利用 QIAseq miRNA Library Kits 随附的 RNA-seq Analysis Portal –一种用户友好型网页式工具，更快、更方便地获得新颖的疾病见解。

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低投入量 RNA-seq

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低起始量 RNA 文库制备可能会面临很大的问题，但这并不一定意味着可信度低。每个工作流程步骤都有可能导致 RNA 的进一步损失。低起始量 RNA-seq 方案通常采用模板切换法构建文库，其检测灵敏度显著高于传统连接法。QIAseq Low Input RNA Library Kits 可最大限度提高灵敏度，并能从低至 1 ng 的总 RNA 中实现链状特性的保留。由于可以选择在逆转录过程中进行整合式 rRNA/球蛋白去除，您能在 5 小时内生成可随时进行 NGS 的高质量文库，同时尽量减少样本损失。

希望将低起始量项目扩展至更大规模？了解 QIAseq Low Input RNA Library Kit 如何允许您根据样本数量、读长预算和测序平台定制您的工作流程。

了解具体方法

靶向 RNA 测序

靶向 RNA-seq 专注于特定 RNA 转录物子集的测序而非全转录组测序；可通过富集法或基于扩增子的方法实现。它可以实现低丰度转录物的检测，在生物标志物验证及特定基因或通路研究中具有显著优势。

如果您在监测基因表达变化或希望利用靶向 RNA-seq 识别融合基因和突变，则文库构建和 NGS 分析中遇到的挑战（如 PCR 偏差和测序伪影）可能危及数据的灵敏度和重复性。

QIAseq 靶向 RNA 测序 Panel 通过专有的 QIAseq 富集技术和分子条形码 (Unique Molecular Index, UMI) 技术应对这些挑战。两项技术协同提升了测序精度、准确性和覆盖均匀性，从而帮助您克服传统 RNA-seq 的局限性并降低偏差率。

了解方法
QIAseq Targeted RNA
走捷径 – 无需定量即可实现文库均一化
文库定量拖沓且耗时？仅需 30 分钟即可轻松实现有效的 NGS 文库均一化，并具有 qPCR 水平的准确性。
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单细胞 RNA 测序简介

单细胞 RNA 测序 (Single-cell RNA sequencing, scRNA-seq) 研究单细胞层级的 RNA 转录物异质性，揭示复杂组织和生物体内部多样化的细胞类型、功能及相互作用。这使其特别适用于研究分化、增殖和肿瘤发生等动态过程。

标准 scRNA-seq 工作流程

  • 细胞分离–从大块组织或细胞悬液中分离单个细胞
  • mRNA 捕获和 cDNA 合成–提取多腺苷酸化 mRNA 并将其转化为 cDNA
  • 文库制备–添加分子条形码 (Unique Molecular Identifier, UMI) 和细胞条形码，以便按细胞区分转录物
  • 测序–文库在 NGS 平台上进行测序
  • 生物信息学分析–分析读长以生成各细胞的基因表达谱

即使面对单细胞或微量 RNA 样本，也无需因此局限对转录组的全景认知。

了解 QIAseq Single Cell RNA Library Kit 如何在短短 5.5 小时内利用分离的细胞构建可直接用于 NGS 的高度复杂性文库。经过优化的化学试剂和无 PCR 方案消除了偏差问题，从而确保转录组覆盖的灵敏度和准确性。

相较于 PCR 更具优势的 QIAseq Single Cell REPLI-g 扩增技术，可对单细胞或其他低起始量 DNA/RNA 样本进行基因组和转录组研究，提供可靠的覆盖范围和均匀的代表性。

访问单细胞中心

RNA 测序分析

难以理解您的 RNA 测序数据吗？我们可提供对应的解决方案！QIAseq RNA Library 和 FastSelect Kit 现已包括了 RNA-seq Analysis Portal–一个为生物学家简化数据分析而设计的基于云端的直观解决方案 — 的免费访问权。RNA-seq Analysis Portal 与 GeneGlobe 完全整合，可让您流畅地从生成 RNA-seq 数据过渡到获取基因表达分析结果。

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NGS 文库制备自动化对您的实验室有什么益处？
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成功故事

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有关如何从降解的低品质 RNA 或难以测序的 RNA 样本中成功获得 RNA-seq 数据的向导

没有获得足够的位于靶向区域上的数据吗？使用的是有限且降解的 RNA 吗？了解 QIAseq RNA-seq 技术在以最优的方式处理最具挑战性样本方面具有哪些优势：

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RNA 测序常见问题解答