Type-it Mutation Detect PCR Kit

マルチプレックスPCRにより変異を高い再現性で正確に解析

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Type-it Mutation Detect PCR Kit (200)

Cat. No. / ID:  206343

For 200 x 25 μl reactions: Type-it Multiplex PCR Master Mix, 5x Q-Solution, RNAse-Free Water, and 10x CoralLoad Dye
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$302.00
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Type-it Mutation Detect PCR Kitは分子生物学的アプリケーション用であり、疾病の診断、予防、あるいは治療に使用することはできません。

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Features

  • 複数の変異を高い再現性で正確に解析
  • 至適化実験なしにマルチプレックスPCRアッセイを確立
  • 全フラグメントを特異的かつ高感度で同時増幅
  • 至適化済みプロトコールで正確な結果を迅速に実現
  • 各種解析用装置を使用する場合の簡単なインストラクション

Product Details

Type-it Mutation Detect PCR Kitは、欠失、挿入、転座のような変異を迅速かつ確実に検出するために特別にデザインされています。特異性の高いHotStarTaq Plus DNA Polymerase と特許を持つバッファーシステムをベースにした本キットは、マルチプレックスPCR により遺伝子座の変異を確実に増幅し、至適化は不要です。続く解析は、アガロースゲル、自動化電気泳動装置、高分離能キャピラリーシークエンシングでも可能で迅速かつ容易に行なえます。

Performance

Type-it Mutation Detect PCR Kitは他社に比べて高性能で、信頼性の高い変異解析を実現します。本キットは、欠失または挿入などの変異および遺伝子組み換え生物や微生物の検出をマルチプレックスPCRベースで分析するために特別に開発され、機能的に検証されています(図“ がん関連遺伝子の変異を高感度検出)。本キットはまた、Applied BiosystemsによるSNaPshotシステム(図“  SNP 検出前の確実なマルチプレックス増幅”)など市販のSNP検出PCRベースのシステムのための事前増幅法として使用するのにも適しています。
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Principle

Type-it Mutation Detect PCR Kit は、実証済みのQIAGENマルチプレックステクノロジーをベースとし、即使用可能なマスターミックスフォーマットで提供されます。本マスターミックスは至適化済みの濃度のHotStarTaq Plus DNA Polymerase、MgCl2、dNTPsと、さらにマルチプレックスPCRベースの変異検出やゲノムSNP遺伝子座の事前増幅用に特別に開発された画期的なPCRバッファーが入っています。また、塩類とバランスよく配合された画期的な添加物であるFactor MP が入っています。これらの成分により、すべてのプライマーのアニーリングおよびエクステンションにおいて同等の効率化を可能にし(図“ 安定で効果的なアニーリング”)、同時に全フラグメントの高収量なマルチプレックス増幅を高い信頼性で実現します。本キットには、変異検出のための専用プロトコール、テンプレート量、サイクル数、およびPCR条件に関するステップごとのアドバイスと同様に、アガロースゲル、キャピラリーシークエンサー、Agilent Bioanalyzer、QIAxcel Advanced Systemなどのダウンストリーム解析のプラットフォーム用ごとに機器の詳細が含まれています。

マスターミックスの成分と専用プロトコールにより、高い特異性ですべてのフラグメントを同時に増幅できます。続く解析は、アガロースゲル、自動化電気泳動装置、高分離能キャピラリーシークエンシングでも可能で迅速かつ容易に行なえます。

Type-it Mutation Detect PCR Buffer

Type-it Mutation Detect PCR Buffer は、多数のマルチプレックス実験においてすべてのアンプリコンを同等の効率で増幅できるため、より多くの標的変異を解析でき、ターゲットで増幅効率のロスがありません。Type-it Mutation Detect PCR Bufferは、特別に開発されたバランスの取れた塩と添加物を組み合わせて、従来のPCR試薬に比べ、反応中の全プライマーのアニーリングとエクステンションを同等の効率で増幅します。このバッファーはユニークな配合比のKClと (NH4)2SO4を含み、従来のPCRバッファーに比べ、幅広い温度やMg2+濃度の範囲で厳密で特異的なプライマーアニーリングを実現します。異なるアニーリング温度あるいはMg2+ 濃度を用いて行なうPCRの至適化は最小限ですみ、または不要なこともあります。従来のマルチプレックスPCR操作で行なう至適化操作は不要です。バッファーに入っている合成 Factor MP (図“ 安定で効果的なアニーリングの促進”)は、プライマー配列に関係なくプライマーのアニーリングとエクステンションを効率的に行ないます。Factor MPは、DNAテンプレート付近のプライマーの濃度を上げ、特異的に結合したプライマーを安定化します。

Q-Solution

Type-it Mutation Detect PCR Kit にはQ-Solutionが添付されていますこの革新的なPCR 添加剤はDNAの変性環境を改善することにより、増幅困難なテンプレートの増幅を可能にします。このユニークな試薬を使用すると、PCR条件が最適でない場合でもPCR が可能になり、改良されることがあります。DMSOや他のPCR 添加物とは異なり、Q-Solution はどのプライマー/テンプレートシステムでも一定のワーキング濃度で使用し、毒性はありません。

CoralLoad Dye

Type-it Mutation Detect PCR Kit に添付の CoralLoad Dye(図“ CoralLoad Dye”) には、ゲルローディング試薬と2種類のマーカー色素が入っており、DNAの移動距離の予測およびアガロースゲルの泳動時間の至適化が容易に行なえます。マルチプレックスPCR反応でCoralLoad Dye を使用する際は、増幅産物を直接アガロースゲルあるいはQIAxcel Advanced System にアプライします。ローディングバッファーを前もって添加する必要がありません。CoralLoad 色素はダウンストリームのほとんどの酵素アプリケーションで影響しません。しかし、再現性のある結果のためには、酵素処理を行なう前にPCR産物の精製を行なうことを推奨します。

検出にキャピラリーシークエンサーを使用する場合には、CoralLoad Dyeを使用しないでください。

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Procedure

Type-it Mutation Detect PCR Kitは、アプリケーションに特化したプロトコールが入っており、それらはルーチン解析新しいアッセイの確立のため信頼性の高い結果を保証するため、同時増幅やその後の変異やSNP含む遺伝子座の検出用に最適化されています。反応は室温で設定することができるので、使いやすく便利です。

迅速かつ簡単な方法で信頼できるジェノタイピング結果を実現

Type-it Mutation Detect PCR Kit は、マルチプレックス・アッセイを迅速かつ簡単に確立でき、正確で再現性のあるジェノタイピング結果が得られます。転座、欠失、挿入の検出、 SNaPshot (Applied Biosystems)のようなSNP検出前のゲノム遺伝子座の増幅などに、テンプレートとプライマーを添加し、至適化済みプロトコールに従ってサーマルサイクラープログラムをスタートするだけで実験ができます。反応ミックスには、変異に特異的なマルチプレックスPCRに必要な試薬が全て入っており、本キットを用いると、通常の方法のように時間がかかる至適化操作なしに正確な結果が得られます(図“ マルチプレックスPCRによる良好なジェノタイピング解析”)。 

簡単な操作法により時間と経費を節約

いくつかの研究では、ある疾病に関与している特定遺伝子の様々な変異(例;欠失、転移、挿入)の多数解析が必要で、その場合singleplexあるいは2 ~ 3種類のマルチプレックスPCR 解析では膨大な数のPCR反応を実施しなければならず、その結果、経費および解析時間の増大に繋がります。Type-it Mutation Detect PCR Kitは、多数のマルチプレックス実験においてすべてのアンプリコンを同等の効率で増幅できるため、経費および実験時間を顕著に抑えてより多くの標的変異を解析できます (図 “ がん関連遺伝子の変異を高感度で検出)。同時増幅やその後の変異やSNPを含む遺伝子座の検出のためのアプリケーションに特異的な専用プロトコールがキットに含まれ、ルーチン解析や新しいアッセイの確立のための信頼性の高い結果を保証します。

SNP 検出前の確実な増幅

Type-it Mutation Detect PCR Kit はまたSNP検出前のマルチプレックスPCRを利用した増幅にも最適です(例;Applied BiosystemsのSNaPshotシステムなど)。本キットは他社のキットより性能が優れ、至適化なしに正確な結果が一定して得られます(“ SNP 検出前の確実なマルチプレックス増幅”)。

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Applications

Type-it Mutation Detect PCR Kitは欠失、挿入、重複、転座などの変異解析、またSNP検出前増幅(例;SNaPshot Multiplex Kit)のために使用でき、以下のような研究分野に利用できます。

  • 疾患遺伝子座のタイピング
  • GMO分析
  • トランスジェネティック植物/動物のタイピング

Supporting data and figures

Specifications

FeaturesSpecifications
ApplicationsMultiplex PCR, detection of mutations, preamplification of SNPs
MastermixYes
Reaction typePCR amplification
Product useFunctionally validated and developed for reliable mutation analyis
Real-time or endpointEndpoint
Sample/target typeGenomic DNA
Single or multiplexMultiplex
With/without hotstartWith

Resources

パンフレット (2)
Second edition — innovative tools
Addressing critical factors and new solutions
キットハンドブック (1)
For optimization-free multiplex PCR-based mutation detection or preamplification of SNPs
MSDS (1)
Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.
テクニカルインフォメーション (1)
Certificates of Analysis (1)
Brochures & Guides (2)
Second edition — innovative tools
Addressing critical factors and new solutions
Kit Handbooks (1)
For optimization-free multiplex PCR-based mutation detection or preamplification of SNPs

FAQ

What is the advantage of using the Type-it Mutation Detect PCR Kit?

The Type-it Mutation Detect PCR Kit was specifically developed and validated for the detection of mutations such as deletions, insertions, and translocations. It is also highly suited for multiplex PCR-based preamplification of SNPs as preparation for genotyping systems like ABI's SNaPshot. Dedicated protocols for various detection platforms (Agarose gels, QIAxcel System, Agilent BioAnalyzer, and Capillary Sequencers) are available in the Type-it Mutation Detect PCR Handbook.

 

 

FAQ ID -2064
How do I setup and validate a multiplex PCR assay with QIAGEN PCR kits?

Ensure PCR amplicons are as short as possible, ideally 60–150 bp. Always use the same algorithm or software to design the primers and probes. For optimal results, only combine assays that have been designed using the same parameters.

 

Check the functionality of each set of primers and probes in individual assays before combining the different sets in the multiplex assay. Choose compatible reporters and quenchers based on a specific instrument. See How do I select appropriate reporter and quencher combinations for multiplex PCR.

 

FAQ ID -9093
Why is CoralLoad included in the Type-it Mutation Detect, but not in the Type-it Microsatellite PCR Kit?

CoralLoad Dye unfortunately interferes with Capillary Sequencers and increases the risk of damaging the capillaries of these detection platforms. It is not included in the Type-it Microsatellite PCR Kit, since microsatellite loci are analyzed predominantly on Capillary Sequencers due to their high-resolution capability.

By comparison, mutations are very often analyzed on agarose gels, or the QIAxcel System, compatible with CoralLoad dye included in the Type-it Mutation Detect PCR Kit.

 

FAQ ID -2068
Are there recommendations for sensitive detection of underrepresented fragments using the Type-it Mutation Detect PCR Kit?

Yes, special recommendations for detecting underrepresented fragments with the Type-it Mutation Detect PCR Kit can be found in Appendix E of the Type-it Mutation Detect PCR Handbook.

 

 

FAQ ID -2066
Can I use uracil-N-glycosylase (UNG) with the QuantiFast and Rotor-Gene PCR kits?

No. UNG treatment does not provide any advantage for the QuantiFast and Rotor-Gene PCR kits because the mastermixes do not contain dUTP. Use the QuantiTect kits if you intend to use the UNG treatment.

FAQ ID -9092
Why do I see multiple high-intensity peaks in my qPCR dissociation curve at temperatures less than 70ºC?

If the extra peaks seem irregular or noisy, do not occur in all samples, and occur at temperatures less than 70 ºC, then these peaks may not represent real PCR products and instead may represent artifacts caused by instrument settings.

 

Usually extra peaks caused by secondary products are smooth and regular, occur reproducibly in most samples, and occur at temperatures greater than 70 ºC. Characterization of the product by agarose gel electrophoresis is the best way to distinguish between these cases. If only one band appears by agarose gel then the extra peaks in the dissociation curve are instrument artifacts and not real products. If this is the case, refer to the thermal cycler user manual, and confirm that all instrument settings (smooth factor, etc.) are set to their optimal values.

 

FAQ ID -90990
How do I quantify gene expression levels if the amplification efficiencies are different between the genes of interest and endogenous reference gene?

The REST 2009 (Relative Expression Software Tool) software applies mathematic models that compensate for the different PCR efficiencies of the gene of interest and reference genes. In addition, the software can use multiple reference gene normalization to improve the reliability of result, as well as provides statistical information suitable for robust comparison of expression in groups of treated and untreated. QIAGEN offers the REST 2009 software free of charge.

FAQ ID -9095
What do I do if no fluorescent signal is detected in a real-time PCR assay?

Check the template quality and integrity by amplifying an endogenous control gene. Check the amplicon by QIAxcel Advanced system or agarose gel electrophoresis to show that amplification was successful.

 

Determine whether the gene of interest is expressed in your sample. See How can I find out if my gene of interest is express in a specific tissue type or cell line.  Ensure the assay setup and cycling conditions are correct, and that the data collection channel matches the emission wavelength of the fluorescent dye used. Use a control sample in which the gene of interest is definitely expressed.

 

If the issue persists, please send the original run file to QIAGEN Technical Services.

FAQ ID -9091
How do I select appropriate reporter and quencher combinations for multiplex PCR?

For duplex analysis, using non-fluorescent quenchers (e.g., Black Hole Quencher®) is preferred over fluorescent quenchers (e.g., TAMRA fluorescent dye). For triplex and 4-plex analysis, QIAGEN strongly recommends using non-fluorescent quenchers. Generally, use the green channel, the yellow channel, and the orange and crimson channels to detect the least abundant target, the second least abundant target, and the two most abundant targets, respectively. For instrument-specific recommendations, please see the handbooks for the QuantiTect Multiplex PCR kit, QuantiFast Multiplex kit or Rotor-Gene Multiplex kit.

 

FAQ ID -9094
Why is the Type-it Mutation Detect PCR Kit recommended for preamplification of SNPs?

Preamplification of SNPs in preparation for genotyping systems like Applied Biosytem's SNaPshot requires single PCRs to be amplified and pooled, before input into this system. Using the Type-it Mutation Detect PCR Kit, all fragments can be obtained at once saving time and costs. Please follow the protocol 'Amplification of Mutations (Detection on Agarose Gels or the QIAxcel System or Agilent 2100 Bioanalyzer)' in the Type-it Mutation Detect Handbook.

 

 

 

 

FAQ ID -2067
Can the Type-it Mutation Detect PCR kit be used for multiplex PCR of fragments longer than 500 bp?

Yes, the Type-it Mutation Detect PCR kit can be used for fragments >500 bp by following the recommendations in the Type-it Mutation Detect PCR Handbook (increase extension time by 30 seconds for each additional 0.5 kb).

 

 

 

FAQ ID -2065
Can I skip the gDNA wipeout buffer treatment step for the QuantiTect Reverse Transcription Kit?

The gDNA wipeout buffer incubation step can be skipped when the total RNA is free from genomic DNA. However, the gDNA wipeout buffer is still required to be added because the reverse transcription step is optimized in the presence of components in the gDNA wipeout buffer.

FAQ ID -9098
How should I handle and store absolute quantitation standards for real-time experiments?
Store the standards at a high concentration in aliquots at -20oC to -70oC. If using low concentrations, stabilize standards with carrier nucleic acid. It is always best to use freshly diluted standards for each experiment. If possible, use siliconized tubes for standard (and target) dilutions. This will prevent any unspecific binding of nucleic acids to the plastic.
FAQ ID -9099
How do I ensure reliable results for High Resolution Melting (HRM) assays?

Reliable HRM analysis results depend on template quality, highly specific HRM PCR kit with a saturation dye, a real-time instrument with HRM capability, and powerful software package. Factors critical for successful HRM analysis are:

 

  • Use the same genomic DNA purification procedure for all samples being analyzed by HRM. This avoids variation due to differing composition of elution buffers.
  • DNA template concentrations should be normalized using the same dilution buffer. Ensure the CT values are below 30 and differ no more than 3 CT values across individual samples.
  • Design assays with amplicon length 70–350 bp. For SNP analysis, use amplicon length 70–150 bp.
  • Always start with 0.7 µM primer concentration

 

For more details, please refer to the HRM Technology – FAQs and the Critical Success Factor for HRM performance.

FAQ ID -9097
How do I avoid collecting a fluorescence reading from primer-dimer with the QuantiTect SYBR Green PCR Kit?

Depending on primer design and copy number of target, primer-dimer may occur and its signal might be detected. Typical strategies against this are to optimize PCR conditions and/or redesign the assay.

 

Alternatively, an additional data-acquisition step can be added to the 3-step cycling protocol. First, determine the melting temperatures (Tm) for both the amplicon and the primer-dimer. Then, add a 15 second data-acquisition step with a temperature that is higher than the primer-dimer Tm, but approximately 3ºC lower than the specific amplicon Tm.

FAQ ID -9096