miRCURY LNA miRNA PCR Assays

Los miRCURY LNA miRNA PCR Assays son juegos de cebadores individuales para PCR de miARN que permiten una cuantificación del miARN sumamente sensible y específica con miRCURY LNA miRNA PCR System. Los cebadores para la amplificación de PCR directa e inversa son específicos para el miARN y están optimizados con la tecnología LNA. Los ensayos están disponibles en formato de tubo o placa con 200 reacciones por tubo o pocillo.

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Sensibilidad inigualable

La sensibilidad excepcional de los miRCURY LNA miRNA PCR Assays se consigue combinando la transcripción inversa universal con cebadores mejorados con LNA y normalizados con T_m. Esta combinación permite una cuantificación precisa y fiable de miARN concretos a partir de tan solo 1 pg de entrada de ARN total en la síntesis inicial de ADNc de la primera hebra (consulte la figura  Cuantificación precisa a partir de solo 1 pg de material de partida de ARN total).
En comparación con otros sistemas de real-time PCR de miARN que utilizan cebadores en horquilla o de ADN estándar, los cebadores mejorados con LNA ofrecen una sensibilidad significativamente mayor, especialmente para los miARN ricos en AT (consulte la figura  Los cebadores mejorados con LNA tienen una sensibilidad significativamente mayor que la de los cebadores de ADN).
Los bajos requisitos de muestras también permiten la cuantificación de miARN utilizando ARN total purificado a partir de muestras difíciles, como muestras de LCM y suero/plasma (consulte las figuras  Detección de expresión diferencial de miARN en muestras de LCM a partir de secciones de tejido FFPE y  Diferencias en expresiones de miARN entre las muestras de suero).

Totalmente validados y optimizados

Todos los miRCURY LNA miRNA PCR Assays validados en laboratorios se han optimizado para ser lo más sensibles posible. Más del 80% de los ensayos detectan al menos 5 copias de miARN en la reacción de PCR (consulte la figura  Dilución en serie de hsa-miR-181a). Los juegos de cebadores también se han validado para la amplificación específica de la diana y para una señal mínima de fondo (consulte la figura  Amplificación específica y sensible de miARN).

La única plataforma con una especificidad perfecta

Los miRCURY LNA miRNA PCR Assays son la única plataforma de cuantificación de miARN con especificidad absoluta (consulte el estudio miRQC publicado en Nature Methods) y superaron a otra plataforma de qPCR de miARN basada en sonda en las pruebas de especificidad (consulte la figura «Prueba de especificidad con sistema de qPCR de miARN basado en sonda»). La especificidad perfecta elimina los falsos positivos y garantiza solo las señales sólidas y fiables de miARN.

Discriminación superior

La incorporación de LNA en los cebadores de amplificación de PCR directos e inversos permite diseñar ensayos que puedan distinguir entre las secuencias de miARN que se diferencian por solo un nucleótido (consulte la figura  Discriminación por un único nucleótido). Además, los ensayos pueden discriminar entre las secuencias de miARN maduro y el miARN precursor.

Rápido, sencillo y reproducible

El protocolo fácil de seguir de 3 horas le permite ahorrar tiempo y esfuerzo en el laboratorio. Al utilizar la misma reacción de RT que el molde en todas las reacciones de PCR posteriores, el procedimiento se simplifica en gran medida en comparación con los sistemas que requieren una síntesis de la primera hebra específica de miARN. El número de pasos de pipeteado se reduce al mínimo y se minimiza la variación técnica. Esto permite alcanzar una reproducibilidad sumamente alta de un día para otro e incluso de un centro a otro.
Los miRCURY LNA miRNA PCR Assays se han optimizado para su uso con el miRCURY LNA RT Kit y el miRCURY LNA SYBR Green PCR Kit. Si se utilizan otros reactivos, esto afectará a la calidad de los resultados.

Un sistema único para la creación de perfiles de miARN

Los miRCURY LNA miRNA PCR Assays ofrecen la mejor combinación de rendimiento y facilidad de uso disponibles en el mercado de real-time PCR de microARN al combinar una RT universal con la amplificación mediante PCR de LNA (consulte la figura  Esquema del sistema de PCR de miRCURY LNA miRNA). La RT universal permite utilizar una reacción de síntesis de la primera hebra de ADNc como molde para varios ensayos de real-time PCR de miARN. Esto ahorra muestras valiosas, reduce la variación técnica y ahorra tiempo en el laboratorio. Además, los cebadores de amplificación de la PCR tanto directa como inversa son específicos de miARN y están optimizados con LNA. Esto proporciona 1) una sensibilidad excepcional y un fondo sumamente bajo, lo que hace posible la cuantificación precisa de niveles de miARN muy bajos, y 2) ensayos muy específicos que permiten la discriminación entre secuencias de miARN estrechamente relacionadas.

Cobertura

Más de 20.000 ensayos disponibles que cubren todos los microorganismo en miRBase 20. Más de 1.400 ensayos que están totalmente validados en laboratorios de química para la sensibilidad, especificidad, eficiencia y fondo en muestras sintéticas y también en distintas muestras biológicas. Los ensayos restantes están validados por ordenador mediante un algoritmo de diseño exhaustivo que garantiza ensayos de alta calidad, específicos para cada especie y mejorados con LNA, con una sensibilidad y especificidad óptimas en cada microrganismo. Esto significa que es posible que varios ensayos distintos se dirijan a la misma secuencia. Por último, el ensayo para cada especie se selecciona según el acervo genético del microorganismo. Si trabaja con miARN nuevos, por ejemplo, en un experimento NGS, también hay disponibles juegos de cebadores de LNA miARN diseñados a medida para cualquier miARN.

Ensayos de genes de referencia para la normalización

Hay disponibles nueve juegos de cebadores de genes de referencia que permiten una normalización de los datos de alta calidad y generar datos fiables a partir de varios tipos de muestras diferentes (consulte la tabla siguiente). Estos juegos de cebadores de control se dirigen a pequeños ARN sin codificación y endógenos que se expresan de forma constitutiva y relativamente estable en los distintos tejidos humanos (consulte la figura  Niveles de expresión de genes de referencia en distintos tejidos humanos). Los genes de referencia de control cubren un amplio rango de valores de C_q, lo que ofrece la posibilidad de normalizar de forma exacta y fiable una variedad de niveles de expresión de miARN.
Los juegos de cebadores de control se han validado como genes de referencia para el miRCURY LNA miRNA PCR System y funcionan de manera óptima con el miRCURY LNA RT Kit and los miRCURY LNA SYBR Green PCR Kits. Es muy importante comprobar siempre la expresión consistente e invariable de un gen en todos los tejidos y en todos los tratamientos de un experimento antes de elegirlo como referencia. Le recomendamos probar varios genes de referencia y utilizar software como GeNorm y NormFinder (que forma parte del software GenEx) para elegir y validar genes de referencia.
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El sistema de miRCURY LNA miRNA PCR Assay es específico de miARN y está basado en LNA para una detección sensible y precisa de miARN mediante real-time PCR cuantitativa con SYBR Green. El primer paso del procedimiento es la transcripción inversa universal y, a continuación, la amplificación de real-time PCR con cebadores mejorados con LNA (consulte la figura Resumen del miRCURY LNA miRNA PCR System).

Los miRCURY LNA miRNA PCR Assays se utilizan como parte del miRCURY LNA miRNA PCR System para:

• Cuantificación de miARN maduro
• Detección de snoRNA