HiSpeed Plasmid Mega and Giga EF Kits

Zur ultraschnellen Aufreinigung von bis zu 10 mg endotoxinfreier transfektionsfähiger Plasmid- oder Cosmid-DNA

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HiSpeed Plasmid Mega EF Kit (5)

Cat. No. / ID:  1054578

HiSpeed Plasmid Mega EF Kit (5)
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459,00 €
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KitAccessories
HiSpeed Plasmid EF Kit
Vacuum manifold
Cartridge type
Mega
Giga
Dieses Produkt enthält Stoffe, die unter REACH (EG 1907/2006 Anhang XIV) geregelt sind. Die Verwendung dieses Produkts in der EU ist im Rahmen einer Ausnahmeregelung zulässig (Artikel 56(3)). Weitere Informationen finden Sie in der REACH-Meldung und im Sicherheitsdatenblatt zu diesem Produkt, die beide im Abschnitt „Ressourcen“ dieser Seite zu finden sind.
HiSpeed Plasmid Mega and Giga EF Kits sind für molekularbiologische Anwendungen vorgesehen. Diese Produkte sind nicht zur Diagnose, Prävention oder Behandlung einer Erkrankung vorgesehen.

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Features

  • Präparationsdauer etwa 50 Minuten
  • Lysatbereinigung und Isopropanolausfällung ohne Zentrifugation
  • Kein Risiko des Verlusts von DNA-Pellets beim Ausfällen
  • Bis zu 10 mg Ausbeute an Plasmid-DNA mit hoher Kopienzahl
  • LyseBlue für optimale Lyse und maximale DNA-Ausbeute
  • Einschließlich Endotoxinentfernung (< 0,1 EU/μg DNA)

Product Details

HiSpeed Plasmid Mega and Giga EF Kits bieten eine vakuumbasierte Plasmid-DNA-Präparation im Großmaßstab auf Anionenaustauschbasis und benötigen zur Elution der finalen Plasmid-DNA nur einen Zentrifugationsschritt. Die aufgereinigte DNA entspricht der durch zweimalige CsCl-Gradientenzentrifugation gewonnenen DNA und eignet sich für transfektionsfähige Anwendungen. Für das Protokoll wird ein QIAvac HiSpeed LS Vakuumverteiler benötigt.
Die HiSpeed EF Mega Giga Kits müssen zusammen mit dem QIAvac HiSpeed LS verwendet werden.

Performance

HiSpeed Plasmid Mega and Giga EF Kits enthalten QIAfilter Cartridges, HiSpeed Tips und QIAconcentrator-Module für die schnelle großtechnische Plasmidpräparation mit Vakuumverteiler. Das vakuumgetriebene QIAfilter-Modul ersetzt den Zentrifugationsschritt im klassischen Anionenaustauschverfahren und beschleunigt und vereinfacht so die Aufreinigung. Der QIAconcentrator liefert hochkonzentrierte DNA durch Zentrifugation nach Ethanolausfällung. Aus 500 ml bzw. 2,5 l Kulturmedium können bis zu 2,5 mg (Mega) bzw. 10 mg (Giga) Plasmid-DNA mit hoher Kopienzahl aufgereinigt werden (das Kulturvolumen hängt von der Plasmid-Kopienzahl, der Größe des Inserts, dem Wirtsstamm und dem Kulturmedium ab). Der Aufbau der HiSpeed Tips ermöglicht eine sehr hohe Durchflussrate, so dass die DNA-Bindung, das Waschen und die Elutionsschritte für die Plasmidaufreinigung schneller erfolgen können. Die mit HiSpeed gewonnene Plasmid-DNA ist endotoxinfrei (<0,1 EU/µg DNA).
Das innovative Anionenaustauscherharz in den HiSpeed Tips wurde ausschließlich für die Aufreinigung von Nukleinsäuren entwickelt. Seine hervorragenden Trenneigenschaften führen zu einer DNA-Reinheit, die der durch zwei aufeinanderfolgende Durchgänge der CsCl-Gradientenzentrifugation erzielten Reinheit gleichwertig oder überlegen ist.
HiSpeed Plasmid Mega and Giga EF Kits entfernen während des Lyseschrittes freigesetzte bakterielle Endotoxine, welche die Transfektion der DNA in Primärzellen und sensitive Kulturzellen beeinflussen. Die aus den HiSpeed Plasmid Mega/Giga EF Kits gewonnene endotoxinfreie DNA eignet sich hervorragend für reproduzierbare und zuverlässige Transfektionsresultate. Die hochreine endotoxinfreie DNA von QIAGEN ist auch für die Gentherapieforschung und andere anspruchsvolle Anwendungen geeignet.

Principle

QIAfilter Cartridges (siehe Abbildung “ QIAfilter Mega-Giga Cartridge”) sind spezielle Filtereinheiten, die den Zentrifugationsschritt nach der alkalischen Lyse von Bakterienzellen ersetzen sollen. QIAfilter Cartridges entfernen SDS-Niederschlag vollständig und bereinigen Bakterienlysate in einem Bruchteil der für die Zentrifugation benötigten Zeit. Die vorverpackten HiSpeed Tips arbeiten nach dem Schwerkraftprinzip und trocknen nie aus, was den Zeitaufwand für die manuelle Plasmidpräparation minimiert.
Der neuartige QIAconcentrator (siehe Abbildung “ HighSpeed Plasmid Giga EF Verfahren”) ersetzt den Zentrifugationsschritt, mit dem traditionell die mit Isopropanol ausgefällte DNA nach der Aufreinigung gewonnen wird. Das QIAconcentrator-Modul hält die ausgefällte DNA zurück, während es vom Isopropanol-Puffer-Gemisch durchströmt wird. Die DNA wird dann einfach aus dem QIAprecipitator in ein Entnahmeröhrchen mit TE-Puffer oder Wasser eluiert. Dieses spezielle Modul eliminiert auch das Risiko des Pelletverlustes, zu dem es beim Abgießen des Überstandes nach der Zentrifugation kommen kann.
Endotoxine, auch bekannt als Lipopolysaccharide oder LPS, sind Bestandteile der Zellmembran gramnegativer Bakterien wie E. coli (siehe Abbildung “ Bakterienzellwand”). Während der Lysephase der Plasmidaufreinigung werden Endotoxine freigesetzt, die bei endotoxinempfindlichen Zelllinien die Effizienz der Transfektion erheblich verringern. Außerdem können Endotoxine die Aufnahme von Plasmid-DNA in Transfektionsexperimenten beeinflussen, indem sie mit der DNA um “freies” Transfektionsreagenz konkurrieren.
Endotoxine lösen auch eine unspezifische Aktivierung von Immunreaktionen in Immunzellen wie Makrophagen und B-Zellen aus, was zu einer Fehldeutung der Transfektionsergebnisse führen kann. Zu diesen Folgen gehört die induzierte Synthese von Proteinen und Lipiden wie IL-1 und Prostaglandin. Insgesamt stellen Endotoxine beim Aufbau von Transfektionsexperimenten eine nicht beeinflussbare Variable dar, die das Resultat und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beeinflusst und deren Vergleich und Interpretation erschwert. In der Gentherapieforschung können Endotoxine durch Auslösung des endotoxischen Schocksyndroms und Aktivierung der Komplementkaskade Störeinflüsse verursachen. >

Spezifikationen
Merkmale HiSpeed Plasmid Mega EF Kit HiSpeed Plasmid Giga EF Kit
Anwendungen Transfektion, Klonierung, Sequenzierung, Gen-Silencing Transfektion, Klonierung, Sequenzierung, Gen-Silencing
Kulturvolumen/Ausgangsmaterial 500 ml Kulturvolumen 2,5 l Kulturvolumen
Plasmidtyp Cosmid-DNA mit hohem Kopienanteil Cosmid-DNA mit hohem Kopienanteil
Verfahren Vakuum, Zentrifugation Vakuum, Zentrifugation
Probe pro Lauf 6 Proben pro Lauf 6 Proben pro Lauf
Technologie Anionenaustausch-Technologie Anionenaustausch-Technologie
Dauer pro Lauf 50 min 50 min
Ausbeute 2,5 mg 10 mg
See figures

Procedure

Neutralisierte Bakterienlysate werden in der QIAfilter Cartridge inkubiert und in Sekundenschnelle durch Vakuum bereinigt. Zu diesem Zeitpunkt wird dem gefilterten Lysat der Puffer zur Endotoxinentfernung zugesetzt. Eine Inkubation ist nicht erforderlich. Das Filtrat wird zur Aufreinigung der Plasmid-DNA auf eine HiSpeed Spitze gegeben (siehe Abbildung “ HighSpeed Plasmid Giga EF-Verfahren”). Die eluierte DNA wird mit Isopropanol vermischt und unter Vakuum in den QIAconcentrator überführt und gewaschen. Die konzentrierte und entsalzte DNA wird dann aus dem QIAconcentrator direkt in ein frisches Entnahmeröhrchen mit TE-Puffer oder Wasser eluiert.

See figures

Applications

Mit HiSpeed Plasmid Mega and Giga EF Kits aufgereinigte DNA liefert hervorragende Ergebnisse bei allen Anwendungen, von der Klonierung und Sequenzierung bis zur Transfektion und dem plasmidvermittelten Gen-Silencing.

Supporting data and figures

Resources

Quick-Start Protocols (1)
Safety Data Sheets (1)
Certificates of Analysis (1)