HiSpeed Plasmid Mega and Giga EF Kits

• Präparationsdauer etwa 50 Minuten
• Lysatbereinigung und Isopropanolausfällung ohne Zentrifugation
• Kein Risiko des Verlusts von DNA-Pellets beim Ausfällen
• Bis zu 10 mg Ausbeute an Plasmid-DNA mit hoher Kopienzahl
• LyseBlue für optimale Lyse und maximale DNA-Ausbeute
• Einschließlich Endotoxinentfernung (< 0,1 EU/μg DNA)

QIAfilter Cartridges (siehe Abbildung “ QIAfilter Mega-Giga Cartridge”) sind spezielle Filtereinheiten, die den Zentrifugationsschritt nach der alkalischen Lyse von Bakterienzellen ersetzen sollen. QIAfilter Cartridges entfernen SDS-Niederschlag vollständig und bereinigen Bakterienlysate in einem Bruchteil der für die Zentrifugation benötigten Zeit. Die vorverpackten HiSpeed Tips arbeiten nach dem Schwerkraftprinzip und trocknen nie aus, was den Zeitaufwand für die manuelle Plasmidpräparation minimiert.
Der neuartige QIAconcentrator (siehe Abbildung “ HighSpeed Plasmid Giga EF Verfahren”) ersetzt den Zentrifugationsschritt, mit dem traditionell die mit Isopropanol ausgefällte DNA nach der Aufreinigung gewonnen wird. Das QIAconcentrator-Modul hält die ausgefällte DNA zurück, während es vom Isopropanol-Puffer-Gemisch durchströmt wird. Die DNA wird dann einfach aus dem QIAprecipitator in ein Entnahmeröhrchen mit TE-Puffer oder Wasser eluiert. Dieses spezielle Modul eliminiert auch das Risiko des Pelletverlustes, zu dem es beim Abgießen des Überstandes nach der Zentrifugation kommen kann.
Endotoxine, auch bekannt als Lipopolysaccharide oder LPS, sind Bestandteile der Zellmembran gramnegativer Bakterien wie E. coli (siehe Abbildung “ Bakterienzellwand”). Während der Lysephase der Plasmidaufreinigung werden Endotoxine freigesetzt, die bei endotoxinempfindlichen Zelllinien die Effizienz der Transfektion erheblich verringern. Außerdem können Endotoxine die Aufnahme von Plasmid-DNA in Transfektionsexperimenten beeinflussen, indem sie mit der DNA um “freies” Transfektionsreagenz konkurrieren.
Endotoxine lösen auch eine unspezifische Aktivierung von Immunreaktionen in Immunzellen wie Makrophagen und B-Zellen aus, was zu einer Fehldeutung der Transfektionsergebnisse führen kann. Zu diesen Folgen gehört die induzierte Synthese von Proteinen und Lipiden wie IL-1 und Prostaglandin. Insgesamt stellen Endotoxine beim Aufbau von Transfektionsexperimenten eine nicht beeinflussbare Variable dar, die das Resultat und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beeinflusst und deren Vergleich und Interpretation erschwert. In der Gentherapieforschung können Endotoxine durch Auslösung des endotoxischen Schocksyndroms und Aktivierung der Komplementkaskade Störeinflüsse verursachen. >

Neutralisierte Bakterienlysate werden in der QIAfilter Cartridge inkubiert und in Sekundenschnelle durch Vakuum bereinigt. Zu diesem Zeitpunkt wird dem gefilterten Lysat der Puffer zur Endotoxinentfernung zugesetzt. Eine Inkubation ist nicht erforderlich. Das Filtrat wird zur Aufreinigung der Plasmid-DNA auf eine HiSpeed Spitze gegeben (siehe Abbildung “ HighSpeed Plasmid Giga EF-Verfahren”). Die eluierte DNA wird mit Isopropanol vermischt und unter Vakuum in den QIAconcentrator überführt und gewaschen. Die konzentrierte und entsalzte DNA wird dann aus dem QIAconcentrator direkt in ein frisches Entnahmeröhrchen mit TE-Puffer oder Wasser eluiert.