蛋白质实验方案和应用指南

Protein Science
蛋白质表达、分析、检测和的注意事项和实验方案
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这里为您介绍蛋白质相关的实验方案和指南,包括蛋白质及其相关的背景知识、其表达、纯化、分析和检测的实验方案等。

何为蛋白质?

蛋白质一词来自希腊语proteios,意思是“头等重要的”。这个术语有瑞典科学家Jöns Berzelius在1838年创造,反映这类分子的重要性。

一段DNA分子称作基因,其携带有构建蛋白质所需的信息。据信在人类基因组(1)中包含有20000到25000个基因,但是在人类蛋白质组(2)中却包含有超过1百万种蛋白质,使得蛋白质成为所有生物学分子中种类最丰富的分子。基因和蛋白质的数量之间的差异是由于这样的事实:一个基因能够产生多种蛋白质,并且产生的蛋白质可以进行化学修饰(通常由其他蛋白质)来改变它们的特性和活性。

蛋白质由氨基酸构建而成。天然存在的氨基酸有二十种,由此构成了所有天然存在的蛋白质。所有二十种氨基酸基于一种通用的结构,差别体现在各自所谓的侧链化学特性方面。一些(例如,色氨酸和苯丙氨酸)是强疏水氨基酸,而其他的(例如,赖氨酸和天冬氨酸)则在生理PH值下携带离子电荷,这使得表现得亲水。氨基酸通过肽键链接在一起形成蛋白质链。蛋白质中氨基酸的排列顺序和蛋白质链折叠的样式决定了其特性。

分子生物学在过去数十年中的进步极大促进了蛋白质研究的进展。以前,获得特定蛋白质的唯一方法就是从天然来源中纯化,这个过程往往非常低效、耗时。随着分子重组生物技术的出现,我们能够克隆一个编码目标蛋白质的DNA并且在表达载体细菌(通常是大肠杆菌中表达出该蛋白质。翻译一段DNA序列即可构建为一种蛋白质,这种遗传密码的通用性使得任何生物体的蛋白质都可以快速而大量表达。

本部分描述了蛋白质表达、分析、检测和实验的程序方法。

天然存在的氨基酸
氨基酸 三字母缩写 单字母缩写
Alanine Ala A
Arginine Arg R
Asparagine Asn N
Aspartic acid Asp D
Cysteine Cys C
Glutamic acid Glu E
Glutamine Gln Q
Glycine Gly G
Histidine His H
Isoleucine Iso I
Leucine Leu L
Lysine Lys K
Methionine Met M
Phenylalanine Phe F
Proline Pro P
Serine Ser S
Threonine Thr T
Tryptophan Trp W
Tyrosine Tyr Y
Valine Val V

大肠杆菌中的蛋白质表达

重组蛋白质表达一般包括:通过构建一个编码目标蛋白的质粒,转移质粒到所需要的宿主细胞,培养宿主细胞并且诱导蛋白表达,然后裂解细胞,纯化蛋白质,操作SDS–PAGE分析来验证获得的蛋白质。

本在线指南的DNA部分中给出的用于处理和转化E. coli的实验方案和重组方法同样适用于重组蛋白的生产。通过仔细选择宿主细胞株系、载体和生长条件,大部分重组蛋白都能在E. coli中高水平的克隆和表达。在尝试大规模蛋白纯化之前需要建立小规模培养,以便优化目标蛋白生长和表达条件。

基本实验方案

培养基

包含表达质粒的E. coli生长所选用的培养基是LB培养基及其改良培养基2x YT或者Super Broth,这几种培养基都含有相关的筛选抗生素。开始时,建议尝试在所有三个培养基中平行表达,并在诱导后进行时程分析以监控生长和表达。我们时常能观察到,在不同时间、不同培养基中,会出现表达水平显著差异。

表达质粒的维持

细胞中质粒维持较差会导致表达水平较低。氨苄青霉素是一种不稳定的抗生素,在生长培养基中会迅速耗尽,其中部分是由耐药细菌细胞分泌的β–内酰胺酶消耗掉的。

将细胞从表达培养基平板接种到添加/不添加氨苄青霉素的平板上以检查质粒水平是很重要的。如果表达结构的稳定性存在问题,则培养物应该在浓度为200 µg/ml氨苄青霉素的培养基上生长,并且在长期培养的过程中要不断补充氨苄青霉素以维持其浓度水平。另外,培养物也可能在羧苄青霉素存在的情况下生长,这是一种更稳定的β–内酰胺,浓度是50 µg/ml。

培养物小规模表达

强烈建议进行小规模表达和纯化实验,并且应该在大规模制备之前进行。在许多情况下,可以在少量样品缓冲液中裂解若干等份的细胞并且直接使用SDS–PAGE进行分析。少量培养物表达的作用是提供一种判断不同生长条件对表达水平以及重组蛋白溶解性的影响快速方法。新转化细胞不同菌落的表达水平各异,而小规模制备可以挑选出最优表达率的菌落。

诱导蛋白表达

诱导蛋白表达所使用的方法依赖于质粒载体和大肠杆菌所用菌株。升高培养温度,或者向培养基中添加化学诱导物(例如异丙基–B–D–硫代半乳糖苷(IPTG)),可以诱导蛋白表达。诱导方法的细节以及相关的质粒请见标准分子生物学(3,4)部分。

蛋白表达的时程分析

为了优化给定蛋白结构的表达,建议使用一种利用SDS–PAGE技术的蛋白表达水平的时程分析方法。细胞内蛋白质含量通常是可溶性蛋白质、形成的细胞包涵体和蛋白质降解之间的平衡。通过检查诱导后不同时间蛋白质的存在,可以建立最佳诱导期。

菌落印迹

我们建议采用菌落印迹法鉴别表达某一种蛋白的菌落和半定量区分不同的表达率。这可能是转化后筛选菌落的较优方法,因为新转化的菌落在表达率方面会显著差异。使用该方法,可以轻松地区分蛋白表达率低至0.1–0.5 mg/L的菌落与不表达蛋白的菌落。

制备菌落印迹

不建议将化学发光法与菌落印迹法共同使用。

实验材料

制备缓冲液、试剂和琼脂平板。参见表10% SDS、变性溶液、中和溶液和 20x SSC。以及琼脂平板。

10% SDS
工作溶液 成分 每升的量
10% (w/v) SDS SDS 100 g
使用HCl 调整至pH 7.2。

 

变性溶液
工作溶液 成分 每升的量
0.5 M NaOH NaOH 20 g
1.5 M NaCl NaCl 87.7 g

 

中和溶液
工作溶液 成分 每升的量
1.5 M NaCl NaCl 87.7 g
0.5 M Tris base Tris base 60.6 g
使用HCl 调整至pH 7.2。

 

20x SSC
工作溶液 成分 每升的量
3 M NaCl NaCl 175.3 g
0.3 M sodium citrate Sodium citrate·2H2O 88.2 g
使用HCl 调整至pH 7.2。

 

琼脂平板

制备:依据表“LB培养基”中给出的成分配制LB培养基。每升添加15 g琼脂糖并混匀,接着高压灭菌。高压灭菌后,轻轻涡旋培养基以便熔融的琼脂均匀的分布于溶液中。请注意在涡旋过程中不要造成热液沸溢。

LB培养基
成分 每升的量
Tryptone 10 g
Yeast extract 5 g
NaCl 10 g

小贴士:在添加热敏抗生素和营养成分前,冷却高压灭菌琼脂培养基到50°C以下(手握时感到温度适宜)。在倾倒平板前,请彻底混匀以便得到均一浓度的培养基。

小贴士:在洁净层流罩内倾倒平板,如果没有层流罩,则在靠近本生灯干净实验台上进行。每个标准90 mm培养皿使用30–35 ml培养基(每升培养基约30个平板)。

倾倒平板后,如果产生气泡,可以用本生灯的火焰快速掠过培养基表面来清除。火焰不得,切勿让火焰在某处来回烧灼,否则可能造成平板切片内的抗生素遭破坏。

在凝固之后或者临使用之前,取下帽盖并将平板立在层流罩内1小时,直接干燥平板。此外,如果您手上没有层流罩,则可轻微开启平板盖,于37°C下在培养箱中干燥平板30分钟,或盖上盖子在室温下倒置放置2–3天。

小贴士:为保持对光线明暗的抗生素的活性,可将平板倒置,在4°C黑暗条件下储存,或者将平板卷在铝箔纸中。存储时间请勿超过3个月,因为这会造成抗生素降解。

操作步骤
  1. 在含有适当抗生素的LB琼脂平板上接种新转化细胞,孵育过夜。
    小贴士:铺展转化混合物涂布后,平板上盖微开启倒置干燥,直到琼脂表面出现褶皱。为了防止涂污,直到所有的液体已被琼脂吸收后,才能开始孵育。
    小贴士:为避免在诱导物缺乏的情况下表达有毒的蛋白质(启动子“渗漏”的结果),并保持质粒的稳定性,请于30℃下孵育。
    小贴士:如果所表达的蛋白质没有毒性并且质粒稳定,可以在37℃下孵育,但应注意,该菌落不得变的太大。
  2. 从培养箱中取出平板,略微打开上盖,干燥10分钟去除冷凝水。
  3. 将干燥的、已编号的硝酸纤维素滤膜放置在琼脂表面并与菌落接触,注意不要引入气泡。
    小贴士:用钝头镊子夹住滤纸的对边,并轻轻地降低放在琼脂表面,使得滤纸中间首先接触,然后再降低(但不要掉落)滤纸的边沿。
    小贴士:用防水标记笔或铅笔对滤纸标号。
  4. 使用注射器针头,在不对称的位置刺破滤纸和琼脂,以方便后续检测是否正确对准。用钝头镊子夹紧滤纸边沿,并将它一次性剥离。
  5. 转移滤纸(菌落的一面朝上)至新鲜的LB琼脂平板上并诱导表达,例如,通过使用含有抗生素和2250 µM IPTG的平板(参见“诱导蛋白表达”)。在此过程中请避免引入气泡。
    小贴士:用钝头镊子夹住滤纸的对边,并轻轻地降低放在琼脂表面,使得滤纸中间首先接触,然后再降低(但不要掉落)滤纸边沿。
  6. 在37℃下孵育平板4小时,将主板在30℃培养箱中孵育4小时,使菌落再生。
  7. 准备一套聚苯乙烯培养皿用于菌落溶解和蛋白质结合到滤纸上。每个盘中应该有使用以下溶液浸泡过的Whatman 3MM paper。
    培养皿1. 10% SDS 溶液
    培养皿2. 变性溶液
    培养皿3. 中和液
    培养皿4. 中和液
    培养皿5. 2x SSC
    注意:丢弃多余的液体,使纸张湿润但不湿透。过量的液体会促进菌落膨胀和扩散,导致信号模糊。
  8. 将硝酸纤维素滤膜(菌落的一面朝上)放置在每个培养皿的顶部,同时注意排除气泡(位于气泡之上的菌落不会正确裂解,并将在最终的染色步骤中产生更大的本底颜色)。在室温下依顺序培养(在步骤7中制备的)聚苯乙培养皿,如下所示:
    培养皿1. 10% SDS 溶液10分钟
    培养皿2. 变性溶液5分钟
    培养皿3. 中和液5分钟
    培养皿4. 中和液5分钟
    培养皿5. 2x SSC 15分钟
  9. 使用显色底物的免疫检测继续进行该实验方案。
    小贴士:由于存在高本底色的问题,不推荐使用化学发光底物实验方案进行菌落吸印转移后的检测。
    注:有时表达蛋白质的菌落与不表达的菌落之间只有轻微的差别。
    小贴士:这一过程要求较短的染色时间,2–3分钟的染色通常是足够的,但是在这个阶段监测显色的变化是非常重要的。
    小贴士:如果仍然难以区分阳性菌落和本底颜色,应该考虑产生高本底色的原因。

应该包括下面的对照:

  • 无表达质粒的宿主细菌平板
  • 含有无嵌入片段的表达质粒的宿主细菌平板
  • 在检测前只用二抗处理过的菌落印迹
  • 表达目标蛋白的阳性对照,如果可能的话
培养标准表达培养物(100ml)
  1. 接种含有相关抗生素的10 ml培养基到50 ml烧瓶中。37°C培养物生长过夜。
  2. 用5 ml过夜培养物接种100 ml预热的培养基(含抗生素),在37°C下生长并剧烈振荡,直到OD 600达到0.6(30–60分钟)。
    小贴士:临诱导前取1ml样品。该样品是非诱导对照。沉淀细胞,在50 µl 5x SDS-PAGE样品缓冲液中重悬。在SDS-PAGE分析前,保存于–20°C下保存。
  3. 诱导表达(例如,添加IPTG至终浓度1 mM)。
  4. 额外孵育培养物4–5小时。
    小贴士:收集第二个1 ml样品。该样品是诱导对照。沉淀细胞,在100 µl 5x SDS–PAGE样品缓冲液中重悬。SDS-PAGE分析前,于–20°C下冻存样品。
    小贴士:如果第一次表达一种蛋白质,每隔一小时取1 ml样品并按上述步骤处理以获得表达的时程。
  5. 4000 x g离心20分钟收获细胞
  6. 在干冰–乙醇或者液氮中冷冻细胞,或者在–20°C下保存细胞沉淀过夜。

 

5x SDS-PAGE样本缓冲液
工作溶液的组成 成分 每升的量
0.225 M Tris·Cl (pH 6.8) 1 M Tris·Cl, pH 6.8 2.25 ml
50% glycerol Glycerol 5 ml
5% SDS SDS 0.5 g
0.05% bromophenol blue Bromophenol blue 5 mg
0.25 M dithiothreitol (DTT)* 1 M DTT 2.5 ml
*不要高压处理DTT.
产品制备(1L)培养物培养
  1. 接种含有相关抗生素20 ml的培养基。在37°C剧烈振荡生长过夜。
  2. 按照1:50比例接种1L培养物与非诱导过夜培养物。在37°C剧烈振荡生长直到OD600达到0.6。
    小贴士:临诱导前立刻取1 ml样品。该样品是非诱导对照。沉淀细胞,在50 µl 5x SDS-PAGE样品缓冲液中重悬。在SDS-PAGE分析前,于–20°C下保存。
  3. 诱导表达(例如,添加IPTG至终浓度1 mM)。
  4. 额外孵化培养物4–5小时。
    小贴士:收集第二个1 ml样品。该样品是诱导对照。在微量离心管中沉淀细胞并于100 µl 5x SDS–PAGE样品缓冲液中重悬。在SDS-PAGE分析前,于–20°C下保存。
  5. 4000x x g离心20分钟收获细胞。在干冰–乙醇或者液氮中冷冻细胞,或者在–20°C下保存细胞沉淀过夜。

蛋白质纯化

重组蛋白的表达和纯化有利于生产和分析几乎任何蛋白质。虽然目前已开发了各种各样的异源表达系统并已用于重组蛋白生产,但是蛋白质纯化仍可能存在有问题。理论上说,我们可以继续采用经典的纯化方法,但在大多数情况下,重组DNA技术允许构建融合蛋白,其中特异性的亲和标签被添加到目标蛋白质序列中;这些亲和标签的作用是通过亲和层析的方法简化重组融合蛋白的纯化过程。理想的情况下,一个标记应该是微小的,并且对重组蛋白的结构、活性和性质的影响最小。不同的亲和标签有不同的大小和特性。相比26 kDa的谷胱甘肽S–转移酶标记,30 kDa的蛋白A和40 kDa的麦芽糖结合蛋白,该6xHis标记大小只是0.84 kDa。FLAG标记只包含8个氨基酸,却是高度免疫原性的,这意味着使用重组蛋白生产抗体之前必须移除FLAG标记。与此相反,His标记具有极低的免疫原性,很少干扰蛋白质的结构和功能,使His标记蛋白适用于各种下游应用而无需标记裂解。

蛋白质分析:SDS-PAGE

SDS-PAGE分析的原理

十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS–PAGE)通过区分蛋白质的大小对其进行分离。在变性和还原的条件下加热蛋白质样品,使其发生去折叠化并由SDS去垢剂分子进行包裹,从而获得与多肽链长度对应成比例的高度网络化的负电荷分子。当载入凝胶基质并放置于电场中时,带负电的蛋白质分子将向带正电的阳极移动,并通过分子筛效应得到分离。再通过蛋白质特异性的染色技术进行显像,之后将蛋白质的移动距离与已知分子量的对照蛋白进行比较,进而可估计出目的蛋白的大小。同时也可将分离所得的蛋白质转印于带正电荷的膜上,并使用蛋白特异性的抗体进行探测,这一程序被称为蛋白质印迹。

丙烯酰胺的浓度

凝胶中所使用的丙烯酰胺浓度是依据所分析蛋白质的分子大小进行选择的。低丙烯酰胺浓度一般用于分离高分子量的蛋白质,而高浓度丙烯酰胺则用于低分子量的蛋白分离过程。通过使用包含浓缩胶和分离胶的非连续电泳系统可进一步提升蛋白质条带的分辨率。

SDS-PAGE凝胶的组成 *
凝胶的丙烯酰胺浓度 分离的线性范围(kDa) 30%丙烯酰胺/ 0.8%双丙烯酰胺溶液(毫升) 2.5×分离胶缓冲液(毫升) 蒸馏水(毫升)
15.0 12–43 2.75 2.2 0.55
10.0 16–68 1.83 2.2 1.47
7.5 36–94 1.38 2.2 1.92
5.0 57–212 0.92 2.2 2.38
* 所示体积针对8 x 8或8 x 10 cm, 1 mm厚的微型凝胶,终体积5.5 ml。
在SDS–PAGE实验之前处理稀释或含盐的样本

为了浓缩稀释的样品或去除样品中高浓度的盐分(可能干扰SDS-PAGE实验),可于SDS-PAGE分析之前对蛋白质进行酸性沉淀处理。

蛋白质TCA沉淀
  1. 将样品稀释至100 µl;再添加100 µl 10%的三氯乙酸(TCA)。
  2. 放置于冰上20分钟;在微量离心机中离心15分钟。
  3. 使用100 µl冰乙醇洗涤沉淀物,挥发乙醇并重悬于5xSDS-PAGE样品缓冲液中。在95°C下煮沸7分钟,之后立即向SDS-PAGE凝胶中上样。
SDS-PAGE分离蛋白质

所需材料

  • 凝胶设备和电泳仪器
  • 30%丙烯酰胺/0.8%双丙烯酰胺原液
  • 2.5x分离胶缓冲液
  • 5x浓缩胶缓冲液
  • 四甲基乙二胺(N,N,N,'N'–四甲基乙二胺,TEMED)
  • 10%过硫酸铵
  • 丁醇
  • 5x电泳缓冲液
  • 5xSDS–PAGE样品缓冲液
  • 蛋白质样品

重要:丙烯酰胺是一种潜在的神经毒素,并可通过皮肤吸收。请采取适当的安全保护措施,特别是在称重固体丙烯酰胺/双丙烯酰胺时和对溶液和凝胶进行操作时。

小贴士:在SDS-PAGE实验中只使用优质的试剂和水。凝胶缓冲液及自制的丙烯酰胺/双丙烯酰胺原液需要过滤、隔绝空气,并储存于4°C下。

30%丙烯酰胺/ 0.8%双丙烯酰胺储存液*
工作溶液的组成 成分 每升的量
30% acrylamide Acrylamide 300 g
0.8% bis-acrylamide (N, N’-methylene-bis-acrylamide) Bis-acrylamide 8 g
* 可从多家供应商处购买即用溶液。

 

2.5x分离凝胶缓冲液
工作溶液的组成 成分 每升的量
1.875 M Tris·Cl Tris base 227.1 g
0.25% SDS, pH 8.9 SDS 2.5 g
使用HCl调整至pH 8.9.

 

5x浓缩胶缓冲液
工作溶液的组成 成分 每升的量
0.3 M Tris·phosphate Tris base 36.3 g
0.5% SDS, pH 6.7 SDS 5 g
使磷酸调节pH值至6.7。

 

5x电泳缓冲液
工作溶液的组成 成分 每升的量
0.5 M Tris base Tris base 60.6 g
1.92 M glycine Glycine 144.1 g
0.5% SDS SDS 5 g
pH应无需调整即为8.8。

 

  1. 按照制造商的说明书组装凝胶板与垫片
    小贴士:凝胶板在使用前需彻底进行清洗和烘干。
  2. 标记分离胶倒入的水平位置——比梳子和样品孔低几毫米。
  3. 在烧杯或类似容器中混合下列溶液(以12%浓度,8x8或8x10厘米大小,1毫米厚度的微型丙烯酰胺凝胶为例)。
    2.2 ml 30%丙烯酰胺/0.8%双丙烯酰胺原液
    2.2 ml 2.5x分离胶缓冲液
    1.1 ml蒸馏水
    5 µl TEMED
    丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液和水的体积需要按照所需的丙烯酰胺百分比进行调整(基于需要进行分离的目的蛋白大小。
    小贴士:凝胶设备的大小需要依据所需凝胶溶液的体积来确定。
  4. 倒入凝胶液之前,加入50 µl 10%过硫酸铵并充分混匀。在组装好的凝胶板之间倒入凝胶液,一直到达第二步所标记的水平线。之后将丁醇覆盖于凝胶上表面。
    小贴士:当使用丁醇可能对设备造成损害时,可以用水代替丁醇——请参见生产商提供的说明书。
    小贴士:一旦加入过硫酸铵,即需在丙烯酰胺完成聚合反应之前尽快倒入凝胶液。
    小贴士:需每次制备新鲜的过硫酸铵溶液
  5. 当聚合反应完成后(20分钟左右),倒掉丁醇,凝胶表面用水漂洗并沥干。
    小贴士:玻板上残存的水滴可用滤纸片吸去。
  6. 混合下列试剂以制作浓缩胶:
    0.28 ml 30% 丙烯酰胺/0.8% 双丙烯酰胺原液
    0.33 ml 5x浓缩胶缓冲液
    1 ml蒸馏水
    2 µl TEMED
  7. 在倒入之前,向凝胶混合物中添加15 µl 10%的过硫酸铵溶液并混合均匀。随后在分离胶上方倒入浓缩胶。插入梳子,避免引入气泡。
    小贴士:一旦加入过硫酸铵,则需在丙烯酰胺完成聚合反应之前尽快倒入浓缩胶。
    小贴士:使用一支记号笔,在拔去梳子之前对样品孔的位置和/或数量进行标记。这将为上样提供便利。
  8. 当浓缩胶完成聚合反应之后(10分钟左右),就可以将凝胶放置于电泳槽中了。向电泳槽之中添入电泳缓冲液,并拔去梳子。
  9. 在上样之前,向4倍体积的蛋白样品中加入1倍体积的SDS-PAGE样品缓冲液(例如向8 µl样品中添加2 µl样品缓冲液,获得10 µl最终样品体积)。简单涡旋之后在95°C下加热5分钟。
    小贴士:在95°C的加热过程中,短暂开启样品管管盖或用针在样品盖上刺出小孔,以释放样品管内逐渐增大的压力。加热之后,对样品进行简单的离心和涡旋步骤。
  10. 上样并运行凝胶电泳。请参考设备制造商所提供的建议来设定电泳条件。
    小贴士:上样之前,使用一支大小合适的注射器和针头,以1x电泳缓冲液冲洗样品孔。
    小贴士:将1x SDS-PAGE样品缓冲液填入未使用的样品孔,以确保样品的移动轨迹不会发生扩散。
    小贴士:确保电极正确地完成连接。蛋白将向正极(标为+,通常为红色)移动。
    小贴士:让电泳一直运行,直至溴酚蓝染料抵达凝胶下缘,这样一般可保证蛋白条带的充分扩展。

SDS-PAGE凝胶中的蛋白显像

蛋白条带显像是通过将凝胶与染色液的共同孵育来完成的。最为常见的两种方法是考马氏染色法和银染法。银染相比考马氏染色更为敏感,在凝胶中能够检测到2–5 ng的蛋白条带。目前有许多可供参考的实验方案,不过为了增加实验结果的可重复性,还是推荐使用市售的试剂盒。蛋白质的银染效果基于银与蛋白质上的巯基或羧基之间的反应,该法不足以进行定量,因为某些蛋白质的银着色不强。此外,蛋白质完成银染之后即被氧化,无法进入测序等后续应用。考马氏染色尽管敏感度稍差,但可以定量,并且考染后的蛋白质仍可进入后续的应用。

考马斯染色法

所需材料

  • 考马斯染色液
  • 脱色液
  • 包含已分离蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶。

 

考马斯染色法
工作溶液的组成 成分 每100 ml的量
0.05% (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250 Coomassie Brilliant Blue R-250 50 mg
40% (v/v)乙醇
乙醇
溶解,然后加入:
40 ml
10% (v/v)冰醋酸 冰醋酸 10 ml
50% (v/v)水 50 ml
使用前过滤
 
脱色液
工作溶液的组成 成分 每100 ml的量
40% (v/v)乙醇 乙醇 40 ml
10% (v/v) 冰醋酸 冰醋酸 10 ml
50% (v/v)水 50 ml
  1. 将凝胶在考马斯染色液当中孵育30分钟至2小时,并温和地摇动。
    小贴士:考马斯亮蓝R染料与蛋白质非特异性地结合。
  2. 在脱色液当中温和地摇动已着色的凝胶,直至凝胶的背景变得透明(1–2小时)。
    小贴士:在褪色溶液中放置一张折叠的纸巾能够吸去多余的染料,这样脱色液可以重复使用。

完成脱色之后,蛋白质在透明的凝胶背景当中显示为蓝色的条带。通常情况下,含50 ng(以上)的蛋白条带可显像。

Western印迹

在完成电泳之后,可通过下列缓冲液槽式转印设备或半干的电转印设备将聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质转印至带有正电荷的薄膜(例如Schleicher and Schuell BA 85型硝酸纤维素膜)上。

在半干的电学印迹法中,凝胶和膜被两叠经电转液润湿的滤纸夹紧在中间。膜放置于阳极(带正电荷)一侧,凝胶则更接近阴极(带负电荷)。施加电流时,SDS包裹的负电荷蛋白质就被转印至膜上。当使用槽式印迹方法时,转印盒被浸没于转印槽中。槽式印迹法可以运转相当长的时间,因为其缓冲容量远远大于半干转印系统。通常情况下槽式印迹法的转印更为有效——特别是对于分子量较大的蛋白——所获得的结果更好。转印效率可以通过在膜上使用丽春红S染色进行确证。一旦蛋白被转印至膜上,就可以使用抗原特异性的抗体或共价结合物对其进行探测。

Western转印

所需材料

  • 转印设备
  • 滤纸(例如Whatman 3毫米滤纸)
  • 带正电荷的薄膜(例如Schleicher and Schuell BA 85硝酸纤维素膜)
  • 包含已分离蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶
  • 电转液(半干转印法或槽式印迹法的配方)

 

半干转印缓冲液
工作溶液的组分 成分 每升的量
25 mM Tris base Tris base 3.0 g
150 mM glycine Glycine 11.3 g
10% (v/v) methanol Methanol 100 ml
pH应无需调整,即为8.3。
 
槽式印迹法转印缓冲液
工作溶液的组分 成分 每升的量
25 mM Tris base Tris base 3.0 g
150 mM glycine Glycine 11.3 g
20% (v/v) methanol Methanol 200 ml
pH应无需调整,即为8.3。

 

  1. 切取8块滤纸和一块薄膜,其大小都等同于凝胶。
    小贴士:为了避免污染,请始终佩戴手套操作滤纸、膜和凝胶。
  2. 将膜在半干转印缓冲液或槽式转印缓冲液中孵育10分钟。
  3. 将滤纸在半干转印缓冲液或槽式转印缓冲液中浸泡。如需进行半干转,进入第4步;如需进行槽式转印则进入第5步。
  4. 半干式转印:注意避免产生气泡,将4片滤纸放置于阴极(带负电,通常为黑色),之后在上面按次序放置凝胶、膜和另外4片滤纸,最后是阳极(带正电,通常为红色)。
  5. 槽式印迹:注意避免产生气泡生,将4片滤纸放置于纤维垫片上,之后按次序放置凝胶、膜和另外4片滤纸,最后是第二块纤维垫片。
    小贴士:产生的气泡会导致该位置蛋白无法转印。可以通过在夹心结构的每一层上轻柔推动一根巴斯德吸管来去除它们。
  6. 完成转印流程。关于您设备使用的特定电流、电压和转印时间,请查阅生产商所提供的说明书。
    小贴士:具体的转印时间主要依据蛋白的大小、丙烯酰胺的浓度和凝胶的厚度来确定。转印效率可通过染色进行监控(见下)。所需场强是通过凝胶的表面面积和厚度来决定的:0.8 mA /cm2是一个比较有用的基准(1个小时转印时间)。
  7. 完成转印之后,在膜上标记凝胶的方向。
丽春红S染色
  1. 将膜放置于丽春红S染色液中缓慢摇动2分钟。
  2. 在蒸馏水中进行脱色,直至看到条带。
  3. 核实不同大小的蛋白均匀转印至膜上的效果。通过增加电转液中的甲醇含量,可使疏水蛋白的转印效率更高。
  4. 使用适当的笔(即使用一支不含水溶性墨汁的笔)或铅笔在膜上做标记,或按需切割薄膜。

 

丽春红S染色溶液
工作溶液的组分 成分 100 ml的量
0.5% (w/v) Ponceau S Ponceau S 0.5 g
1% (v/v)冰醋酸 冰醋酸 1 ml

斑点印迹

斑点印迹法是一项用于直接检测原始裂解液或溶液中蛋白的简便方法,无需使用SDS–PAGE进行蛋白分离。该方法特别适于作为简单的对照实验,因为它避免了由于Western转印过程所带来的相关问题。不过任何干扰结合的成分,或非特异性结合的成分,都将无法与蛋白质分离,从而对信号强度造成影响。总是需要使用适当的对照,来对此不足加以补偿。

所需材料

  • 硝酸纤维素膜(例如Schleicher and Schuell BA85型)蛋白质样品
  • 蛋白样本
  • 天然或变性条件下的稀释缓冲液

 

工作溶液的组分,pH 8.0 成分 每升的量
8 M urea Urea 480.5 g
100 mM NaH2PO4 NaH2PO4·H2O 13.8 g
10 mM Tris·Cl Tris base 1.2 g
使用HCl调整至pH 8.0。
天然条件的稀释缓冲液
工作溶液的组分,pH 8.0 成分 每升的量
50 mM NaH2PO4 NaH2PO4·H2O 17.5 g
300 mM NaCl NaCl 6.9 g
使用NaOH调整至pH 8.0。

 

  1. 使用缓冲液稀释蛋白样品,使蛋白终浓度达到1–100 ng/µl。
    小贴士:使用变性条件的稀释缓冲液、天然条件的稀释缓冲液或另外优选的缓冲液对目的蛋白进行稀释。
  2. 直接向膜上滴加1 µl稀释的蛋白样品。也可直接使用原始的细胞裂解液,滴加1 µl浓度估值为1–100 ng/µl蛋白的样品。
    注:特别是在天然条件下,该抗体对应的抗原决定簇必须至少形成部分的裸露,以完成抗体结合反应。在大多数情况下,使用含有变性剂的缓冲液稀释蛋白会增加抗原决定簇的暴露机会,从而改善结果。
    小贴士:为了对非特异性信号与阳性信号进行有效区分,可于膜上额外滴加1 µl不含质粒的宿主菌细胞抽提物样本(或其他适当的对照),与目的蛋白共同进行处理和观察。
  3. 点样之后,在室温下短暂晾干薄膜,之后再进入检测环节。
    小贴士:如需检测较大的样本体积,可选择某些供应商所提供的适当仪器。
  4. 进行免疫检测。

蛋白质检测:在膜上由特异性抗体所介导的蛋白质检测

抗体的运用

抗体是动物在对外界异物(抗原)的响应中所专一合成的蛋白。通过向动物体内注射抗原,经过一段时间之后在动物的血清中即可采集针对注入蛋白的特异性抗体,即所谓的IgG(免疫球蛋白G)。每一抗体都对抗原上的某一特定区域具有专一亲和力。抗原上的这一区域被称为抗原决定簇。抗体——抗原决定簇之间的相互作用被人们用来对膜上固着的蛋白样本进行特异而又敏感的检测,称为免疫检测。与靶标蛋白特异性结合的抗体称为第一抗体,它们通常是从兔或小鼠中获得的。在膜表面孵育一抗,使其与靶蛋白相互结合。之后为了对一抗进行定位(也就定位了靶蛋白的位置),还需要二抗体。二抗能够针对性地识别和结合另一动物来源的所有免疫球蛋白G抗体。因此实验中所使用的二抗需要直接识别和结合一抗来源动物的IgG。例如,如果一抗是源自小鼠,那么可以使用山羊抗小鼠的二抗进行检测。二抗通常与化学报告基团相偶联,从而方便对抗体检测和显影。通常该报告基团是一些荧光素分子,或能够生色或介导发光反应的酶。一抗如果直接化学偶联报告酶,则称之为偶联物,可用于直接检测而无需二抗参与。

检测膜上的蛋白

当蛋白样本从SDS–PAGE凝胶中转印至膜上之后,还需对膜上剩余的无蛋白位点进行封闭。通过这一步骤能够避免一抗或二抗与膜直接结合,造成很高的本底信号。通常使用的一些封闭剂包括脱脂奶粉、牛血清清蛋白(BSA)和酪蛋白。封闭处理完成后,加入一抗与蛋白进行结合。洗脱之后(去除非特异性结合的抗体),再加入二抗对之前的一抗进行检测。再次洗脱之后,二抗的结合位点(也就是一抗和靶蛋白的位置)通过加入二抗偶联酶的底物进行探测。酶的底物被催化能够在反应位点生成有色化合物(显色反应),或发光(化学发光检测)。通常情况下将专一性识别某一特定抗原决定簇的抗体应用于对重组蛋白的检测,能够免去对蛋白特异性抗体的依赖,这样仅使用一种抗体就可以检测几乎所有包含该抗原决定簇的重组蛋白。将报告酶与该类抗体直接偶联可进一步免除对二抗的需求,从而在很大程度上节省实验的时间成本。关于免疫检测实验流程的详细信息,请参阅最新的《Molecular Biology》手册(3,4)。

使用化学发光法进行免疫检测

所需材料

  • 蛋白质印迹
  • TBS缓冲液
  • TBS–Tween/Triton缓冲液
  • 封闭缓冲液
  • 一抗(蛋白特异性)原液
  • 二抗—酶偶联物原液
  • 二抗稀释缓冲液
  • 化学发光底物

注:当进行化学发光检测时,BSA通常不足以完全封闭二抗对膜的非特异性结合效果,所以通常使用奶粉来稀释二抗。不过在某些案例中,使用奶粉缓冲体系进行二抗稀释也可能造成检测敏感性的降低。如果遇到此类情况,应使用BSA溶液稀释一抗,使用牛奶稀释二抗。

TBS缓冲液
工作溶液的组分,pH 7.5 成分 每升的量
10 mM Tris·Cl Tris base 1.2 g
150 mM NaCl NaCl 8.8 g
使用HCl调整至pH 7.5。

 

TBS-Tween/Triton缓冲液
工作溶液的组分,pH 7.5 成分 每升的量
20 mM Tris·Cl Tris base 2.4 g
500 mM NaCl NaCl 29.2 g
0.05% (v/v) Tween 20 Tween 20 500 µl
0.2% (v/v) Triton X-100 Triton X-100 2 ml
使用HCl调整至pH 7.5。

 

封闭缓冲液
工作溶液的组分 成分 每升的量
3% (w/v) BSA in TBS buffer BSA* dissolved in TBS buffer 30 g
替代品: 1% (w/v) alkali-soluble casein in TBS buffer 碱溶性酪蛋白溶解于TBS缓冲液 10 g
* 含有BSA或奶粉的缓冲液应每次使用时新鲜制备。其他缓冲液应储存在2-8℃,以避免微生物腐败。不要使用叠氮化物作为杀菌剂,因为其会抑制过氧化物酶检测反应。

 

二抗稀释缓冲液
工作溶液的组分 成分 每升的量
10% (w/v)脱脂干奶粉溶解于TBS缓冲液 脱脂干奶粉溶解于TBS缓冲液 100 g
替代品: 1% (w/v)碱溶性酪蛋白溶解于TBS缓冲液 碱溶性酪蛋白溶解于TBS缓冲液 10 g

 

所有的孵育和洗脱步骤都应该在振动式摇床或轨道式摇床上进行。

  1. 在室温下使用TBS缓冲液对膜进行洗脱,每次10分钟。
  2. 在室温下使用封闭缓冲液与膜孵育1小时。
    小贴士:需要使用塑料薄膜密封孵育容器,以避免蒸发作用。
  3. 在室温下使用TBS–Tween/Triton缓冲液对膜洗脱两次,每次10分钟。
  4. 在室温下使用TBS缓冲液对膜洗脱10分钟。
  5. 在室温下将膜与一抗溶液(使用封闭缓冲液按照1/1000–1/2000的比例稀释一抗原液)共同孵育1小时。
    小贴士:确保膜被抗体溶液完全覆盖。一直保持膜的湿润。
    小贴士:为了减少对抗体体积的需求,可以使用塑料袋将膜密封。
  6. 在室温下使用TBS–Tween/Triton缓冲液对膜洗脱两次,每次10分钟。
  7. 在室温下使用TBS缓冲液对膜洗脱10分钟。
  8. 在室温下将膜与二抗稀释液(含有10%脱脂奶粉和二抗的TBS缓冲液)共同孵育1小时。依照厂商建议对二抗进行稀释。
    小贴士:请确保您所用的二抗直接对应于一抗的来源物种!
    小贴士:奶粉能够有助于减低本底,因为BSA不足以对极敏感的化学发光检测法进行完全封闭。
    小贴士:使用最低的建议浓度,以避免产生假阳性信号。
  9. 在室温下使用TBS–Tween/Triton缓冲液对膜洗脱4次,每次10分钟。
  10. 实施化学发光检测反应,使用塑料薄膜将蛋白膜包裹,并依照厂商建议进行X光底片的曝光。
    小贴士:请确保您选择了正确的化学发光检测底物,例如对AP偶联抗体使用AP底物,或对HRP偶联抗体使用HRP底物。
    小贴士:蛋白印迹膜可以使用塑料薄膜包裹并储存于4°C。也可对蛋白印迹进行脱抗体反应(stripping),再使用其它不同的抗体进行检测(5)。
使用显色法进行免疫检测

所需材料

  • 蛋白质印迹
  • TBS缓冲液
  • TBS–Tween/Triton缓冲液
  • 封闭缓冲液
  • 一抗(蛋白特异性)原液
  • 抗体–酶偶联物原液
  • 显色底物

注意:使用显色法的检测过程中,封闭缓冲液和二抗稀释液中均可使用3% BSA(重量体积比)。

显色底物的免疫印迹
显色底物* 缩写 反应产物
过氧化物酶底物:3,3'-Diaminobenzidine DAB 棕色、不溶
过氧化物酶底物:3-Amino-9-ethylcarbazole AEC 红色、不溶
过氧化物酶底物:4-Chloro-1-naphthol 4C1N 蓝色、不溶
碱性磷酸酶底物:5-Bromo-4-chloro-3-indoylphosphate/Nitro blue tetrazolium BCIP/NBT 蓝色、不溶
* 应在使用前,新鲜制备碱性磷酸酶底物溶液或辣根过氧化物酶反应的溶液。

 

所有的孵育和洗脱步骤都应该在振动式摇床或轨道式摇床上进行。

    1.
  1. 按照使用化学发光法进行免疫检测方案中的1–7步骤进行实验。
  2. 使用含有3% BSA(质量体积比)的TBS缓冲液稀释二抗,并在室温下将膜与二抗溶液共同孵育1小时。遵照厂商建议进行抗体稀释。
    小贴士:请确保您所使用的二抗直接对应于一抗的来源物种。
    小贴士:使用最低的建议浓度,以避免产生假阳性信号。
  3. 在室温下使用TBS-Tween/Triton缓冲液对膜洗脱4次,每次10分钟。
  4. 使用AP或HRP染色液对膜进行染色,直至出现清晰的信号(大约5–15分钟)。在显色过程中不要振动膜。
    小贴士:请确保您选择了正确的显色底物,例如对AP偶联抗体使用AP底物,或对HRP偶联抗体使用HRP底物。
  5. 将膜用水漂洗两次以中止显色反应。
  6. 沥干蛋白膜并尽快完成拍照,因为反应生成的颜色会随时间减淡。HRP的显色尤其不稳定。

蛋白质分析:ELISA

酶联免疫吸附(ELISA)是一种与蛋白膜上免疫检测类似的方法,通常用于液相蛋白的定量检测。在ELISA实验中,蛋白被固着于固相载体(例如96孔板的孔)上,作为俘获分子与靶标蛋白进行结合。通过洗涤去除非特异性结合之后,再加入针对靶标蛋白的二抗。二抗一般与酶相偶联,从而可以通过显色反应或化学发光法实现检测。

在一种ELISA分析方法中,识别靶标蛋白上的抗原决定簇的特异性抗体被作为固定相,对所加入的检测溶液进行结合。固定的抗体将捕获样品中存在的靶蛋白。通过洗涤步骤去除非特异性的结合,之后加入二抗,与蛋白上的二抗原决定簇进行结合。也可(另一方法)将蛋白固定于固相载体上,测试溶液中与蛋白相结合的抗体可以通过加入二抗来得到检测和定量。

在96微孔板上包被蛋白用于ELISA检测

该法被用来将蛋白固定于96微孔板的内表面。之后即可使用一抗和二抗,以类似于蛋白质印迹的方式对蛋白进行分析。

开始前的重要事项

  • 与聚苯乙烯材质结合的难易程度由特定蛋白的自身属性所决定。对结合条件的优化是必要的。请参考生产商提供的说明书。
  • 在实验初始阶段,应比较使用三种不同pH值的缓冲液。
  • 在4–37°C进行结合反应。成功的结合也受蛋白质稳定性的影响。

所需材料

  • 适当的96微孔板

包被缓冲液

PBS缓冲液,pH 7.2
50 mM 碳酸钠,pH9.6
50 mM 碳酸钠,pH10.6
微孔板封闭缓冲液

PBS, pH 7.2
工作溶液的组分 成分 每升的量
50 mM磷酸钾 0.5 M K2HPO4
0.5 M KH2PO4
71.7 ml
28.3 ml
150 mM NaCl NaCl 8.8 g
pH应无需调整即为7.2。

 

50 mM碳酸钠, pH 9.6
工作溶液的组分 成分 每升的量
50 mM Na2CO3 Na2CO3·H2O 6.2 g
使用NaOH调节pH至9.6。

 

50 mM碳酸钠, pH 10.6
工作溶液的组分 成分 每升的量
50 mM Na2CO3 Na2CO3·H2O 6.2 g
使用NaOH调节pH至10.6。

 

微孔板封闭缓冲液
工作溶液的组分 成分 每升的量
2%蔗糖 蔗糖 20 g
0.1% BSA BSA 1 g
0.9% NaCl NaCl

 

  1. 使用包被缓冲液对需要固定的蛋白样本倍比稀释。
  2. 每孔加入200 µl蛋白溶液,在4°C下孵育过夜。
  3. 使用PBS缓冲液对每孔洗涤4次。每次对孔洗涤10–60秒,在纸巾上轻敲96孔板以控干水分。
  4. 在摇床上使用250 µl微板封闭缓冲液对孔内表面进行2小时的室温(20–25°C)封闭。
    小贴士:封闭之后,96孔板可在20–25°C下干燥过夜,但检验的敏感性会下降。
    小贴士:干燥之后,96孔板可暂时放置于4°C一段时间等待使用,不过实际效果还是依赖于所分析特定蛋白的自身属性。
  5. 使用PBS缓冲液对每孔洗涤4次。每次对孔洗涤10–60秒,在纸巾上轻敲96孔板以控干水分。
  6. 按照实验方案 使用蛋白特异性抗体进行蛋白分析 进行操作。
使用蛋白特异性抗体进行蛋白分析

开始前的重要事项

  • 检测抗体应在室温下进行至少1小时的结合反应。如果检出的蛋白浓度非常低,或抗原决定簇被部分地遮蔽,进行2–4小时或过夜的孵育可能会增加检测灵敏度。
  • 在摇床上进行所有操作将有助于获得最佳结果。如果无摇床可供使用,增加孵育时间(室温增长至2–3小时或在4°C下过夜)或孵育温度可能有助于抗体的充分扩散。
  • 抗体稀释方法主要视所使用的具体抗体而定。请参考厂商建议,或以蛋白质印迹或斑点印迹分析的有效浓度开始,尝试使用进一步稀释的样本。使用0.1 µg/ml浓度至1 µg/ml的第一单克隆抗体浓度,通常可获满意效果。对每个抗体都可在此浓度区间进行滴定检测,以确定最佳的稀释浓度。
  • 适当的阴性对照是必不可少的。分析应一直与不含任何蛋白(单独的裂解液/稀释液,空白试剂)或缺乏靶蛋白(例如使用空白载体(无蛋白编码片段插入)转化的大肠杆菌裂解产物)的样本平行进行。这些对照都需要与抗体及其后的分析组分进行孵育。注意:本实验方案仅设定为一个具体案例。单个蛋白和抗体的最佳条件应该进行针对性的测定。
  • 如要建立一个新的分析体系,应首先针对蛋白或抗体与固相之间的结合效果进行优化(孵育时间和蛋白用量)。分析中的一抗或其他二级组分在之后进行优化。

所需材料

  • 完成蛋白包被的微型96孔板
  • PBS/BSA
  • PBS
  • 靶蛋白的特异性抗体
  • 二抗偶联物
  • 碱性磷酸酶底物,或辣根过氧化酶某一替代性底物。关于底物的更详尽资料请参见表 蛋白质分析中蛋白底物的详细资料。

 

PBS/BSA*
工作溶液的组分 成分 每升的量
0.2% BSA in PBS BSA溶于PBS 2 g
*含有BSA的缓冲液应在每次使用前新鲜制备。

 

磷酸盐– 柠檬酸盐缓冲液,pH 5.0
成分 Volume
0.2 M Na2HPO4 251.5 ml
0.1 M柠檬酸 48.5 ml

 

碱性磷酸酶的底物:磷酸对硝基苯酯(pNPP)
成分
pNPP 50 mg
1 M二乙醇胺; 0.01% MgCl2·6 H2O, pH 9.8 10 ml

 

辣根过氧化物酶底物:2,2'azino-bis[3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid] ABTS
成分
ABTS 10 mg
磷酸–柠檬酸缓冲液 10 ml
在使用前加入30% H2O2 2 µl

 

辣根过氧化物酶底物的替代品:邻苯二胺(OPD)*
成分
OPD 10 mg
磷酸–柠檬酸缓冲液 10 ml
在使用前加入30% H2O2 2 µl
*这一底物灵敏度较高,但取决于使用的抗体,其也可能导致背景信号增强。

 

辣根过氧化物底物替代品:3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB)
成分
TMB 10 mg
DMSO 1 ml
溶解,之后加入磷酸–柠檬酸缓冲液 9 ml
*这一底物灵敏度较高,但取决于使用的抗体,其也可能导致背景信号增强。
蛋白质底物的蛋白质测定方法的详细说明
底物 监测变色的波长 终止试剂* 用于确定终止产物的波长
pNPP 405 nm 3 M NaOH 405 nm
ABTS 415 nm 1% SDS 415 nm
OPD 450 nm 3 M HCl or
3 M H2SO4
492 nm
TMB 370 nm or 650 nm 2 M H2SO4 450 nm
*反应停止时,信号会稍微增强,这取决于所使用的底物,颜色会稳定一段时间。

 

  1. 使用PBS/BSA以1/2000比例稀释靶蛋白特异性的抗体,加入200 µl抗体稀释液。盖上96孔板并在室温下孵育1–2小时。
    为了提高灵敏度,抗体可于4°C下孵育过夜。
  2. 使用PBS–Tween缓冲液对每孔洗涤4次。每次对孔洗涤10–60秒,清洗后在纸巾上小心轻敲96孔板以控干水分。
  3. 按照厂商建议使用PBS/BSA缓冲液稀释二抗。每孔加入200 µl抗体稀释液并于室温下孵育45分钟。
  4. 使用PBS–Tween缓冲液对每孔洗涤4次。每次对孔洗涤10–60秒,清洗后在纸巾上小心轻敲96孔板以控干水分。
  5. 加入200 µl底物溶液,在酶标仪中监控颜色变化。
    注意:底物溶液需现配现用。
    小贴士:在45分钟内监视颜色变化,或于特定时间加入50 µl终止试剂并检测产物。当检测一个新的分析系统时,需要对整个显色反应的时间进程进行观察,以确定最优的显色时间和温度。
    小贴士:如果显色反应已经终止,底物的信号强度将会略微增加(基于所使用的具体底物),生成的颜色将在一定时间内保持稳定。

使用Bradford法定量蛋白质

Bradford法是一种定量蛋白的测定方法,该法基于考马氏亮蓝染料与蛋白样品的结合反应,通过使用已知数量的标准蛋白(一般使用BSA)建立标准曲线,再将样品的显色强度与标准曲线进行比较来完成定量。

在这一检测中,蛋白样品需要使用适当的缓冲液进行稀释(通常即使用它们的溶解液)。同时也应该使用相同的缓冲液建立BSA(牛血清清蛋白)标准曲线。

所需材料

  • BSA标准溶液(1 mg/ml)
  • Bradford分析染料(市售产品,如Bio–Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate,产品号500–0006)
  • 蛋白稀释缓冲液

注意:应使用蛋白样品的溶解体系进行进一步稀释。请使用同种缓冲体系建立标准曲线。

注意: BSA标准液的浓度应使用光度计进行测定。1 mg/ml BSA溶液的A280值应为0.66。

  1. 制备标准曲线时,需按照表格“用于Bradford蛋白测定的标准曲线样品”中所列出的溶液体积对BSA进行小心混匀,对应的标准品浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/ml BSA。所有样品的体积均为200 µl。
  2. 将染料分装,并使用蒸馏水以1:5的比例进行稀释。将每份BSA稀释液各吸取20 µl至一塑料试管内,再加入1 ml稀释后的染料混匀,并于室温下孵育5分钟。
    注意:在避光保存的条件下,稀释后的染料在2周之内保持稳定。在保存瓶上记下制备日期,并以铝箔覆盖。
  3. 测量每个样品在595 nm处的OD值,并以此绘制标准曲线。
  4. 制备第二标准曲线时,需按照表格“用于Bradford蛋白测定的标准曲线样品”中所列出的溶液体积对BSA进行小心混匀,对应的标准品浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg/ml BSA。所有样品的体积均为200 µl。
  5. 将染料分装,并使用蒸馏水以1:5的比例进行稀释。将每份BSA稀释液各吸取20 µl至一塑料试管内,再加入1 ml稀释后的染料混匀,并于室温下孵育5分钟。
  6. 测量每个样品在595 nm处的OD值,并以此绘制标准曲线。
  7. 制备靶蛋白样品的稀释液,并取2份20 µl稀释液样本,按照上述方法进行测定。精确按照生成标准曲线的样品制备方法对测试蛋白样品进行处理是十分重要的。通过与标准曲线上的OD595数值进行比较来计算测试样本的蛋白浓度,并按照稀释比例还原真实浓度。

 

Bradford蛋白分析的标准曲线
BSA浓度(mg/ml) BSA标准溶液的体积(µl) 蛋白质梯度稀释液体积(µl)*
0 200
0.05 10 190
0.1 20 180
0.2 40 160
0.3 60 140
0.4 80 120
0.5 100 100
0.6 120 80
0.8 160 40
1.0 200
*使用与稀释蛋白相同的缓冲液。

参考文献

  1. International Human Genome Sequencing Consortium (2004) Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431, 931.
  2. Jensen, O.N. (2004) Modification-specific proteomics: Characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 33.
  3. Ausubel, F.M., et al. (1999) Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons.
  4. Sambrook, J. and Russell, D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.
  5. Kaufmann S.H., Ewing, C.M., and Shaper, J.H. (1987) The erasable Western blot. Anal. Biochem. 161, 89.

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