디지털 PCR의 응용
디지털 PCR로 무엇을 할 수 있나요?
디지털 PCR, 특히 QIAGEN 나노플레이트 기반 기술은 오늘날 묻고 답할 수 있는 질문을 근본적으로 변화시켜 연구에 혁명을 가져오고 있으며, 이전에는 qPCR 및 기타 dPCR 기술의 한계로 인해 가로막혔던 응용 분야에 활력을 불어넣고 있습니다. 다음 섹션에서는 일부 현재 및 새로운 공정에서 디지털 PCR을 사용할 때의 이점을 설명합니다.
희귀 돌연변이 검출
희귀 돌연변이 검출(Rare mutation detection, RMD)은 야생형 배경 풀에서 매우 낮은 빈도(1% 미만 또는 심지어 0.1%)로만 존재하는 시퀀스 변이체를 검출하는 것을 의미합니다. 따라서, 점 돌연변이 또는 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)과 같은 희귀 사건을 검출하고 정량화하기 위해서는 민감하고 정확하며 정밀한 방법이 필요합니다. 문제는 하나가 다른 것보다 훨씬 더 풍부하게 존재하는 경우 두 개의 매우 유사한 시퀀스를 구별하는 데 있습니다.
희귀 돌연변이 검출의 예로는 암 생검 검체 내에서 낮은 빈도 단일 뉴클레오티드 돌연변이를 검출하는 것이 있습니다.
복제수 변이 분석
복제수 변이(Copy number variation, CNV) 분석은 개인의 유전체에 있는 특정 유전자의 복제 수를 결정합니다. 유전자는 유전체당 2개의 복제로 발생하는 것으로 알려져 있지만, 이러한 유전자는 경우에 따라 더 자주 발생할 수 있습니다. 유전자 증폭(종양 유전자를 활성화) 및 결실(종양 억제 유전자를 비활성화)은 점 돌연변이, 전위 및 역전과 같은 유전체 변화 외에도 암 관련 유전자에 영향을 미치는 중요한 복제수 변경(copy number alteration, CNA)입니다. CNA에 의해 영향을 받는 대부분의 암 관련 유전자는 암 발생 및 암 진행과 관련된 암 신호전달 경로에서 매우 중요한 유전자로 정의되었습니다. 복제수 변이(Copy Number Variation, CNV)는 유전적 다양성(유전자좌의 결실 또는 중복)의 필수 원천이며 흔히 발생하는 신경계 및 자가면역 질환, 유전적 병태 및 약물 부작용과 관련된 유전자를 연구할 수 있습니다.
유전자 발현 분석
유전자 발현 프로파일링은 두 개 이상의 검체 간에 다중 유전자의 발현 수준을 동시에 비교합니다. 이 분석은 과학자들이 표현형 차이의 분자적 기초를 확립하고 심층 연구를 위한 유전자 표적을 선택하는 데 도움이 될 수 있습니다. 유전자 발현 프로파일링은 정상적인 생물학적 상태와 질병에서 차등적 유전자 발현의 역할에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
miRNA 발현 분석
MicroRNA(miRNA) 발현 프로파일링은 두 개 이상의 검체 간에 다중 또는 단일 miRNA의 발현 수준을 동시에 비교합니다. 이 분석은 과학자들이 암과 같은 급성 질병의 바이오마커로서 miRNA를 식별하고 정량화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 정상적인 생물학적 상태와 질병에서 miRNA 발현의 역할에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
미생물 병원체 검출
속도, 높은 민감도, 정확도 및 절대 정량화의 조합은 공중 보건 및 역학에서 병원체 검출 및 미생물군집 분석 모두에 필수적입니다. 이는 병원체 및 미생물체의 변화를 식별, 검출, 특성 분석 및 모니터링하기 위해 계통 발생을 연구할 때 필수적입니다. 응용 분야는 식품 내 병원체, 약물 내성, 미생물 연구, 항균제 내성 유전자 조사 등에 이르기까지 광범위합니다. 병원체 검출 시, 미생물 병원체는 바이러스/박테리아-숙주 관계에서와 같이 종종 바이러스와 동시에 검출됩니다.
바이러스 부하 정량화
바이러스 부하 검사에서는 생물학적 검체 내 특정 바이러스의 양을 측정합니다. 결과는 검체 밀리리터당 바이러스 RNA의 복제 수로 보고됩니다. 바이러스 부하 검사는 급성 바이러스 감염을 진단하고 치료 선택을 안내하며 의학적 치료에 대한 반응을 모니터링하는 데 사용됩니다.
액상 생검
유체 생검 또는 유체 상 생검으로도 알려진 액상 생검은 비고체 생물학적 조직, 주로 혈액의 검체 채취 및 분석입니다. 액상 생검은 암과 같은 질병에 대한 진단 및 모니터링 도구로 주로 사용됩니다. 액상 생검은 조직 생검에 비해 공여자에게 덜 침습적입니다. 종양 세포가 죽으면 ctDNA를 혈액으로 방출합니다. ctDNA의 암 돌연변이는 전통적인 종양 생검에서 발견되는 돌연변이를 반영하기 때문에, 질병을 추적하기 위한 분자 바이오마커로 사용할 수 있습니다. 문제는 혈액 내 종양 세포의 ctDNA 농도가 낮다는 것입니다. 표준 방법은 NGS, 파이로염기서열 분석 또는 real-time qPCR을 사용하는 것이었으나, 이들 방법의 단점은 LOD의 한계였습니다. 종양 조직에 대한 파이로염기서열 분석은 약 10%, NGS는 1–5%이며 qPCR은 1%까지 검출할 수 있습니다. 이는 검출 수준의 제한으로 인해 공여자의 잔류 질병 모니터링 동안 재발의 경우 문제가 됩니다.
GMO 검출
유전자 변형 생물체(Genetically modified organism, GMO)는 일반적으로 유전적으로 변형된 농산물을 지칭하는 데 사용됩니다. 유전 공학은 바이러스/곤충 저항성, 작물 수확량 증가, 조성 강화 등과 같은 원하는 특정 형질을 도입하는 기술을 제공합니다. GMO 검출은 정성적(존재) 또는 정량적(GMO의 양)일 수 있습니다. 검출은 특정 GMO에 고유한 DNA 시퀀스의 존재를 검출하는 사건 특이적이거나 GMO에 삽입된 외래 DNA 시퀀스를 검출하는 구성체 특이적일 수 있습니다. GMO 검사는 많은 농산물 생산자/수출자/수입자가 규제 요건을 충족하는 데 필요합니다. 현재 가장 많이 사용되는 방법인 real-time PCR은 복잡한 식품/사료에서 흔히 관찰되는 낮은 DNA 표적을 검출하고 정량화하는 데 한계가 있습니다.
유전체 편집 검출(CRISPR-Cas9)
유전체 편집 연구에서, 모든 세포의 유전체를 편집하는 데 아연 집게(ZFN), 탈렌(TALEN) 및 클러스터 된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(clustered regular interspaced short palindromic repeat, CRISPR) 등의 핵산분해효소가 사용됩니다. 이들 핵산분해효소는 부위 특이적 DNA 이중 가닥 절단(double-strand break, DSB)을 생성하고, 이는 그 다음에 부정확하고 오류가 발생하기 쉬운 비상동 말단 연결(non-homologous end joining, NHEJ)(공여자 템플릿/고정밀 점 돌연변이) 또는 상동성 지시 복구(homology-directed repair, HDR)(삭제/결실/삽입) 경로에 의해 복구되어 표적 돌연변이 유발로 이어질 수 있습니다. 그 결과, 이질적인 삽입결실(indel) 오류와 다양한 대립유전자 편집 빈도가 있는 혼합된 세포 개체군이 발생합니다. 그런 다음 원하는 유전자좌의 유전체 편집 빈도를 측정합니다. 클론 세포주가 단일 세포를 분리한 다음 이를 분석하여 유전체 편집 사건을 확인합니다.
NGS 라이브러리 정량화 및 검증
오늘날 NGS 라이브러리 정량화 및 검증은 다양한 방법으로 수행됩니다. 분광광도계 및 형광 광학계와 qPCR의 사용은 생성된 라이브러리를 정확하게 정량화하는 데 제한이 있습니다. 비용 효율적이고 정확한 염기서열 분석 실행을 위해서는 라이브러리의 정확한 농도가 매우 중요합니다. Real-time PCR은 지금까지 염기서열 분석 실행의 검증에 대한 표준이었습니다. 단점은 NGS에서 1% 미만의 결과를 검증해야 할 때 정밀도가 부족하다는 것입니다.
잔류 숙주 세포 DNA 정량화
잔류 숙주 세포 DNA(host cell DNA, HCD)는 치료용 단백질 및 백신 제조 과정에서 생깁니다. 허용 수준은 미국 식품의약국(FDA) 및 세계보건기구(WHO)와 같은 규제 기관에서 설정합니다. 디지털 잔류 DNA 정량화 키트는 복잡한 바이오프로세스에서의 숙주 세포 DNA(Host Cell DNA, HCD)를 높은 정밀도로 정량화하는 데 이상적입니다. 유전자 요법, 세포 기반 백신 및 유사한 생물치료제 또는 기타 개발 과정에서 제거되는 세포는 HEK293, CHO 또는 E. coli일 수 있습니다.
출판물
QIAGEN 나노플레이트 PCR 기술을 사용하는 공정에 대한 나날이 증가하는 논문 목록을 살펴보세요.
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