RNA isolation tips
마이크로바이옴

RNA 분리 팁

토양으로부터 고품질 mRNA의 성공적인 분리

토양에서 RNA 분리는 환경 분자 생물학에서 수행되는 가장 어려운 어플리케이션 중 하나입니다. 분해가 지속적인 문제가 될 뿐만 아니라 RNA 수율도 낮은 경향이 있습니다.

토양 부식산 및 억제제 함량에 의한 RNA의 공동 오염 가능성도 문제입니다. RNA 응용을 위한 순도는 필수입니다. RNA는 반응에 추가될 때 농축되어 있야 하며 억제제가 존재해서는 안 됩니다.

보통 DNA 수율이 10~20%인 낮은 RNA 수율은 연구용으로 샘플을 분리하기 위해서 더 큰(15ml) 튜브와 더 큰 용량의 원심분리기를 사용하여 더 많은 양의 샘플로 작업해야 함을 의미합니다. 낮은 복제 유전자를 찾을 때 역전사를 위한 RNA의 희석을 피하는 것이 가장 좋기 때문에 성공적인 억제제 제거가 핵심입니다.

이러한 문제를 해결하기 위해 QIAGEN®은 토양 RNA 추출을 간단하게 하기 위해 특별히 개발된 RNeasy® PowerSoil® Total RNA Kit를 제공합니다.

프로토콜은 신중하게 테스트된 다음 방법의 조합으로 이루어져 있습니다: 억제제 제거를 위한 Inhibitor Removal Technology(IRT®), 완전한 미생물 용해를 위한 페놀-클로로포름 추출 및 고품질 정제를 위한 음이온 교환. 최종 결과는 RT-PCR에서 최대로 사용할 수 있도록 순수한 RNA를 원하는 부피로 분리하는 것입니다.

양토 삼림 토양에서 강 퇴적물에 이르기까지 모든 토양은 질감, 수분 및 미생물 부하가 다릅니다. RNeasy PowerSoil Total RNA Kit를 사용하여 추출 프로세스를 각각에 맞게 조절할 수 있습니다.

열 가지 RNA 분리 팁

다음은 RNeasy PowerSoil Total RNA Kit 프로토콜의 단계를 따를 때 문제를 피하고 결과를 최적화하기 위한 10가지 팁입니다.

Protocol step
팁 1: 시작 샘플의 양을 신중하게 고려합니다.

대부분 토양의 경우, 샘플당 최대 양은 2g입니다. 그러나 퇴적물의 경우에는 증가된 수분 함량 때문에 2g 샘플 내 토양 입자가 더 적습니다. 이로 인해 이미 미생물 부하가 낮은 샘플에서 RNA 수율이 감소할 수 있습니다. 따라서 침전물의 경우에는 최대 5g의 습중량 샘플이 권장됩니다.

참고: 채취 후 토양 위에 상당한 양의 물이 고여 있는 경우 비드 튜브에 샘플을 추가한 후 샘플을 잠깐 원심분리하여 과도한 수분을 제거할 수 있습니다.

Protocol step
팁 2: 토양에 적합한 PCI를 사용합니다

올바른 페놀: 클로로포름: 이소아밀알코올(PCI) 종류가 중요합니다. 키트 안내서에 포함된 권장사항을 참조하십시오. 페놀은 PCI의 25:24:1 비율이어야 하고 TE 완충액 pH 8.0에서 보관할 때 pH는 6.7~8이어야 합니다. RNA 준비 시 낮은 pH 페놀이 적합한 동물 조직 및 세포 샘플과는 달리 토양 샘플은 최상의 결과를 위해 중성 pH 페놀이 필요합니다.

Protocol step
팁 3: 이소프로판올(isopropanol) 침전을 최적화합니다.

PCI 추출 및 용액 SR3에 첨가한 후, 다음 단계는 전체 핵산을 분리하기 위한 이소프로판올(isopropanol) 침전입니다. 침전물로 시작했다면 SR3을 추가한 후 샘플이 5ml 이상일 수 있습니다. 완전한 침전이 되도록 하기 위해 프로토콜 단계 11에서 샘플의 부피와 동일하도록 SR4(이소프로판올, isopropanol)의 양을 늘려야 합니다.

팁 4: 고염도 샘플의 경우에는 이소프로판올(isopropanol) 침전 온도를 조절합니다.

표준 키트 프로토콜에서는 샘플을 -20°C에서 동결합니다. 그러나 염도가 높은 샘플의 경우 영하의 온도로 인해 염분이 침전되어 정제 시 음이온 교환 컬럼에 대한 결합 조건이 변경되므로 상온에서 침전을 수행하는 것이 더 좋습니다. 펠릿 모양으로 샘플에서 염분이 침전되었는지 알 수 있습니다. 일반 RNA 펠릿과 같이 평평하고 광택이 있는 것이 아니라 크고 딱딱한 경우 염분이 존재할 수 있습니다. 민물 호수의 퇴적물 샘플에도 과도한 물 때문에 염분이 있는 경향이 있습니다.

중단점: 일부 토양의 경우 결과를 손상시키지 않고 단계 12에서 30분 이상 또는 밤새도록 배양을 연장하는 것이 가능할 수 있습니다. 하지만 먼저 귀하의 토양 샘플에 대해 이것을 테스트해야 합니다.

Protocol step
팁 5: 컬럼을 통한 적절한 유속을 확인합니다.

RNA의 최종 정제에 사용되는 컬럼은 중력을 이용하여 컬럼을 통해 흐르도록 패킹된 레진입니다. 때로는 레진이 채워져 있기 때문에 컬럼 내 유속이 느릴 수 있습니다. 양압을 부드럽게 적용하면 음이온 교환 컬럼을 통한 완충액 및 샘플의 유속을 증가시킬 수 있습니다.

참고: 유속에 있어 지속적인 어려움이 있는 경우 5ml 주사기의 몸통(barrel)을 사용하여 컬럼에 가벼운 압력을 가하여 유속을 향상시킬 수 있습니다. 이렇게 하려면 주사기 몸통의 끝부분을 컬럼 입구와 같은 높이로 잡습니다. 몸통을 잡고 플런저를 주사기로 밀어 넣어 공기가 컬럼 상단 주위로 빠져나가지 않도록 합니다. 초당 1방울의 유속을 넘지 않도록 하면서, 아주 부드럽게 압력을 가합니다.

팁 6: 구성성분을 충분히 혼합합니다.

때때로 이소프로판올(isopropanol)이 포함된 용액이 선반 위에 있는 동안 분리될 수 있습니다. 사용하기 전에 SR5 및 SR6 용액을 흔들어서 용액이 균질하도록 합니다. 보통 10초간 흔들면 충분합니다.

Protocol steps
팁 7: 용출 시 시간을 절약합니다.

이전에 키트를 사용한 적이 있고 연구실에서 자신이 있는 경우 15ml 튜브 대신 2ml 채집 튜브에 직접 용리하여 시간을 절약할 수 있습니다. 그러면 이송 단계가 생략되고 플라스틱 폐기물이 덜 생깁니다. 이 방법을 사용하는 경우, 중력 컬럼은 랙의 채집 튜브 위에 확실하게 균형을 유지해야 합니다.

Protocol step
팁 8: 최종 이소프로판올(isopropanol) 침전을 위한 적절한 온도를 확인합니다.

중력류 컬럼에서 용출한 후, 다시 이소프로판올(SR4 용액)을 사용하여 최종 침전을 수행하고 -20°C에서 배양합니다. 이 단계를 실온이 아닌 -20°C에서 수행하는 것이 중요합니다.

중단점: 이용 가능한 시간에 준비가 완료되지 않으면 몇 시간 또는 밤 동안 여기서 프로세스를 중단할 수 있습니다. -20°C에서 동결된 샘플에서 RNA는 안정적입니다.

Protocol step
팁 9: RNA 펠릿을 잘 관찰합니다.

이소프로판올에서 RNA를 수집하기 위한 원심분리 후, 정상적인 펠릿은 작고 유리질입니다. 이소프로판올을 따라낼 때 모든 튜브에서 펠릿이 있는 위치를 신속하게 식별할 수 있도록 원심분리기의 튜브가 같은 방향이 되도록 해야 합니다.

참고: 조직 배양 후드가 켜져 있는 동안 조직 배양 후드의 기류 흡입구에서 보풀 없는 천 위에 튜브를 (거꾸로) 놓아 펠릿 건조를 가속화할 수 있습니다.

Protocol step
팁 10: RNA 재현탁에 사용하는 물의 양을 고려합니다.

건조한 펠릿을 얻은 다음, 역전사에 필요한 정도를 기준으로 한 양에 RNA를 재현탁합니다. 예를 들어 토양 내에 높은 수율의 미생물이 있는 경우 50~100ul의 물에 재현탁할 수 있습니다. (보통, 최종 농도는 100~200ng/ul입니다.) 미생물 바이오매스가 낮은 퇴적물 및 건조한 토양을 사용할 경우 RNA가 더 농축되도록 25ul가 바람직합니다. 이 단계에서는 펠릿의 재현탁을 위한 최적의 물 양을 유연성 있게 결정할 수 있습니다.