Scientist analyzing dPCR results on dPCR system
디지털 PCR

dPCR 분석 개발 및 문제 해결

디지털 PCR 프로토콜 — 개요

디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 분석 개발은 실험의 템플릿, 사용 기기, 응용 분야, 목표를 비롯한 많은 요소에 따라 달라집니다. 대부분의 디지털 PCR 프로토콜에는 다음 단계의 변형이 포함됩니다.

검체 준비 — dPCR 분석

검체 준비는 높은 PCR 효율을 달성하는 데 있어 핵심 단계입니다. 디지털 PCR을 위한 시작 템플릿을 준비할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 매개변수가 있습니다.

이러한 매개변수에는 다음이 포함됩니다.

  • 검체 순도
  • 구조 측면에서의 검체 무결성
  • 검체 길이 및 서열
  • 검체 투입량
  • 복제본 사용
  • 대조물질 사용

dPCR 실행을 개선하기 위해 이러한 요소를 최적화하는 방법은 아래에서 설명합니다.

Pipetting as the first step of sample preparation in a dPCR protocol

검체 순도

PCR은 여러 라운드의 효소 반응을 기반으로 하기 때문에 단일 단계 효소 촉매 반응보다 단백질, 페놀/클로로포름, 염, 에틸렌다이아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic Acid, EDTA)와 같은 불순물에 더 민감합니다. 오염 물질이 형광 검출을 방해할 수 있기 때문에 핵산 템플릿의 순도는 dPCR에 중요합니다.

  • 알코올(에탄올, 이소프로판올)과 염은 프라이머와 프로브 어닐링 특성을 손상시키고 증폭 효율을 감소시킵니다(예: 양성 형광 감소, 양성 및 음성 분획의 식별 방해)
  • 휴민산은 dsDNA 결합 염료(예: EvaGreen)의 형광을 억제합니다
  • 핵산분해효소는 RNA와 DNA를 분해합니다
  • 우레아와 페놀은 Taq 중합효소를 변성시킵니다
  • 산성 다당류는 핵산을 모방하고 Taq 중합효소와 함께 종말복합체(dead-end complexes)를 형성합니다

dPCR은 qPCR보다 억제 효과가 적지만 템플릿 순도가 높은 템플릿을 사용하여 최적으로 작동합니다. 유전체 DNA, 플라스미드 DNA, total RNA 등 템플릿에 따라 높은 핵산 순도와 PCR 효율성을 얻을 수 있도록 다양한 키트가 제공됩니다.

검체 무결성: 길이 및 서열

앰플리콘 길이와 서열은 dPCR 실험의 성공 여부를 결정하는 데 템플릿 순도만큼 많은 영향을 미칩니다. 강하게 분해된 템플릿 RNA와 DNA는 흡광도(Optical Density, OD) 로 정량화한 DNA 양과 dPCR을 통해 증폭하고 검출한 복제수가 일치하지 않는 경향이 있습니다. 원하는 민감도(예: 돌연변이 검출)를 달성하려면 예상보다 많은 DNA 양이 필요할 수 있습니다. 특히 심하게 분해된 검체(FFPE DNA, cfDNA)를 사용하는 경우 앰플리콘을 가능한 한 짧게 유지하는 것이 좋습니다.

마찬가지로 잔존하는 가교결합으로 인해 가닥 분리 및 증폭이 발생하지 않고 무염기 부위에서 비특이적 증폭이 유도될 수 있습니다. 전용 키트 및 프로토콜을 사용하여 FFPE 검체에서 고품질 gDNA를 복구할 수 있습니다.

검체 무결성: 구조

임의의 템플릿 분할은 dPCR 프로토콜을 사용한 정확한 정량화에 매우 중요합니다. 균일한 PCR 신호 분포는 FFPE(Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) DNA, 순환 무세포 DNA(Circulating Cell-Free DNA, ccfDNA), 상보적 DNA(Complementary DNA, cDNA), gBlock을 비롯한 대부분의 템플릿 DNA에서 관찰됩니다.

복잡한 구조를 가진 고분자량 템플릿이 균일하게 분포되도록 하려면 제한 분해와 같은 전략을 사용하는 것이 좋습니다.

더 읽어보기
dPCR

다음과 같은 경우 디지털 PCR 분석 전에 제한 분해를 사용하는 것이 좋습니다.

  • 고점성 용액 – 고점도는 특히 더 적은 양에 더 많은 DNA를 사용할 때 측정 정확도를 떨어뜨릴 수 있습니다. 점도를 줄이기 위해 제한 분해를 사용하면 dPCR 프로토콜에서 훨씬 더 높은 DNA 농도(1μg)를 사용할 수 있습니다.
  • 연결된 또는 동시 유전자 사본 - 하나의 양성 분획에 사본이 여러 개 포함된 경우 연결된 사본은 하나의 사본으로 계산됩니다. 이 문제는 물리적으로 유전자 사본을 분리하여 파티션에 따로 분리하는 제한 분해를 사용하여 해결할 수 있습니다.
  • 초나선 플라스미드 – 플라스미드 DNA를 선형화하고 DNA에 대한 프라이머/프로브 결합의 접근성과 효율성을 개선하려면 제한 분해를 사용하는 것이 좋습니다. 그러면 플라스미드 정량화의 정확도가 향상됩니다.
  • 거대 DNA 분자(>30kb) – 거대 DNA 분자는 고르지 않게 분할되어 템플릿 농도가 과도하게 정량화될 수 있습니다. 제한 분해는 큰 템플릿을 더 작은 크기로 단편화하는 데 도움이 되므로 균일한 분포와 더 정확한 정량화가 가능합니다.
주의 사항
제한 효소를 선택할 때 효소가 앰플리콘 서열 자체 내에서 절단되지 않아야 합니다.

검체 투입량

검체 투입량은 사용된 dPCR 기술에 따라 다릅니다. QIAcuity 나노플레이트 디지털 PCR에서는 26k 나노플레이트에서 반응당 최대 217,000개 복제본을 사용할 수 있고, 8.5k 나노플레이트에서는 최대 170,000개의 복제본을 사용할 수 있습니다.

복제수 계산 방법

유기체의 반수체(haploid) 유전체 크기가 알려진 경우 유전체 DNA(gDNA)의 대량 투입과 그에 따른 복제수(단일 복제 유전자의 경우) 사이의 상관관계는 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다.

유전체 크기(bp) x 단일 염기쌍의 평균 무게(1.096 x 10–21g/bp) 

예를 들어 유전체 크기가 약 3.3 x 109bp인 인간 게놈의 경우 계산은 다음과 같습니다.

3.3 x 109 bp x 1.096 x 10−21 g/bp = 3.3 x 10−12 g = 3.3 pg
아래 표는 다양한 모델 유기체에서 gDNA 10ng의 복제수를 보여줍니다
유기체 유전체 크기 Gene copies (1 copy/haploid genome) in 10 ng gDNA
호모 사피엔스 3.3x109 3000
Zebrafish 1.7x109 5400
Saccharomyces cerevisiae 1.2x107 760,500
Escherichia coli 4.6x106 2,000,000
Standard plasmid DNA 3.5x103 2,600,000,000

주의 사항
dPCR에서 평균 복제/분획 수가 5를 초과해서는 안 됩니다. 0.5에서 3 사이가 이상적입니다.

복제본

피펫팅 오류로 인해 정량화가 편향되지 않도록 하려면 검체를 이중 또는 삼중으로 분석하는 것이 좋습니다. 중복된 데이터를 함께 추가하면 측정된 이벤트 수가 증가합니다. 이렇게 하면 디지털 PCR 분석의 정밀도를 높이는 데 도움이 됩니다.

대조물질

  • 음성 대조물질 – 프라이머 및 프로브의 오염이나 문제로 인해 발생할 수 있는 위양성 반응을 모니터링하는 데 필요합니다. 음성 대조물질은 검출 한계(Limit of Detection, LOD)를 결정하는 데에도 사용됩니다.
  • 양성 대조물질 – 설정된 반응 조건에서 템플릿 증폭이 발생하는지 검사하는 데 사용됩니다
  • 주형 없는 대조물질(Non-Template Control, NTC) – 모든 시약의 오염을 제어합니다
QIAcuity 시스템의 디지털 PCR: 소개
웨비나에서는 QIAcuity 기기에서 디지털 PCR의 다양한 기본 측면을 다루며 템플릿 및 해당 농도 선택에 대해 설명합니다.
지금 시청하기

검출 화학

DNA 결합 염료

EvaGreen과 같은 형광 DNA 인터컬레이팅 염료(intercalating DNA dye)는 모든 이중 가닥 DNA 분자에 결합하고 결합 시 정의된 파장의 형광 신호를 방출합니다. 신호 강도는 PCR 생성물의 축적으로 인해 주기 수가 증가함에 따라 높아집니다. EvaGreen과 같은 DNA 결합 염료를 사용하면 다양한 표적을 분석할 수 있을 뿐만 아니라 표적 고유의 라벨이 지정된 프로브를 통합하지 않아도 됩니다. 그러나 비특이적 PCR 생성물 및 프라이머 이합체는 형광 신호에 영향을 줄 수 있으며 디지털 PCR 데이터 분석 중에 별도의 형광 신호 클러스터로 나타날 수도 있습니다. EvaGreen 염료를 사용할 때는 높은 PCR 특이성이 필수적입니다. 

Fluorescence detection using DNA intercalating dyes in digital PCR
Fluorescence detection using primers/probes in digital PCR

가수분해 프로브

TaqMan 프로브라는 가수분해 프로브는 형광단 및 소광제 부분이 결합된 서열 특이적 올리고뉴클레오티드입니다. 형광단은 프로브의 5프라임 말단(5' end)에 결합되고 소광제(quencher)는 3프라임 말단(3' end) 또는 관심 서열 내에서 내부적으로 결합됩니다. PCR의 확장 단계 중 프로브는 Taq DNA 중합효소의 5′→3′ 엑소뉴클레아제 활성에 의해 절단되어 형광단과 소광제(quencher) 부분을 분리합니다. 그 결과 축적된 PCR 생성물 양에 비례하는 형광 신호를 검출할 수 있습니다.

dPCR 문제 해결 팁은 보고자와 소광제(quencher)의 특정 조합을 방지해야 한다는 것입니다. 예를 들어 소광제(quencher)의 방출과 형광 염료의 방출이 겹치는 경우 해당 형광 채널에서 추가 배경 신호가 생성됩니다. 이 배경 노이즈는 클러스터 분리 및 피크 해상도에 악영향을 미칩니다. 

프라이머 및 프로브 설계 방법

디지털 PCR 분석을 성공적으로 수행하려면 프라이머와 프로브를 효과적으로 설계해야 합니다. dPCR 프로토콜의 프라이머 및 프로브 설계는 qPCR 분석과 동일한 규칙을 따릅니다. 프라이머 및 프로브 설계 과정에서 중점적인 영역은 다음과 같습니다.

  • 표적 매칭
  • 기본 구성
  • 앰플리콘 길이
  • 융해온도
  • 이차 구조의 부재
  • 자체 상보성 및 상호 상보성 부재(self-annealing)
  • 교차 반응성의 부재
Optimizing primer design and probe design for digital PCR assays
디지털 PCR 프로토콜을 위한 프라이머와 프로브 설계의 한 가지 차이점은 dPCR의 프라이머 및 프로브 농도가 qPCR보다 높은 경향이 있다는 것입니다. 프라이머 및 프로브 농도가 높을수록 형광 강도/진폭이 증가하여 특정 신호에서 배경 노이즈를 더 잘 분리할 수 있습니다. 궁극적으로 타겟을 더 정확하게 정량화할 수 있습니다. 실험 결과에 따르면 최종 농도 0.5µM – 0.9µM의 프라이머 집합과 반응당 0.25µM의 프로브에서 최적의 결과를 얻을 수 있습니다.

프라이머 및 프로브 보관

신중한 분석 설계와 적절한 프라이머 및 프로브 농도의 사용 외에도 프라이머와 프로브의 올바른 보관은 dPCR의 성공에 매우 중요합니다.

동결건조된 프라이머와 프로브는 TE Buffer 100μM(Tris·Cl 10mM, EDTA 1mM, pH 8.0)과 같은 소량의 저염 완충액에 용해하여 농축 원액을 제공해야 합니다. 예외적으로 Cy5 및 Cy5.5 형광 염료 라벨이 붙은 프로브는 더 높은 pH에서 분해되는 경향이 있으므로 Buffer TE, pH 7.0에 보관해야 합니다.

프라이머를 보관하기 위해 핵산분해효소가 없는 소량의 TE Buffer 분취량을 -20°C에서 최소 1년 동안 보관할 수 있습니다. 형광 라벨이 붙은 프로브는 동일한 조건에서 6~9개월 동안 안정적입니다. 열화 위험을 줄이기 위해 동결-해동 주기가 반복되어서는 안 됩니다.

dPCR 멀티플렉스 분석에 사용되는 프라이머-프로브 세트의 경우 제시된 농도에서 특정 표적에 대해 프라이머 2개와 프로브 1와 함께 20x 프라이머-프로브 혼합물을 사용할 수 있습니다.

프라이머 및 프로브를 재구성하려면 동결 건조된 프라이머 또는 프로브가 포함된 튜브를 부드럽게 원심분리하여 튜브 바닥에 모든 물질을 수집해야 합니다. 핵산분해효소가 없는 멸균 TE Buffer를 필요한 만큼 추가하고 혼합한 다음 프라이머 또는 프로브가 완전히 용해되도록 20분 동안 그대로 두어야 합니다. 프라이머 또는 프로브 용액을 다시 혼합하고 분광광도법으로 농도를 결정해야 합니다. dPCR 문제 해결 팁은 프라이머와 프로브가 물에 용해되지 않도록 하는 것입니다. 이러한 프라이머 및 프로브 중 일부는 TE Buffer보다 물에서 용해도와 안정성이 더 낮습니다. 

dPCR 실행 수행

A representation of the nanoplate dPCR workflow

표준 나노플레이트 dPCR 워크플로우에는 검체 로드, 증폭, 데이터 분석이라는 세 가지 주요 반응 단계가 있습니다.

dPCR 반응 단계를 최적화할 때 양질의 qPCR 결과를 생성하는 qPCR 조건이 종종 dPCR에 직접 적용될 수 있습니다. 그러나 특정 요구 사항에 대한 제조업체의 권장 사항을 항상 확인하는 것이 좋습니다. 

검체 로드 팁

세 가지 dPCR 반응 단계 중 첫 번째는 검체를 준비하고 로드하는 것입니다. PCR 혼합물을 준비하고 나노플레이트를 로드하는 동안 다음 권장 사항을 따르는 것이 좋습니다.

  • 외부 DNA 오염 위험을 줄이기 위해 작업 공간과 실험 기구의 오염을 제거합니다
  • PCR 효율을 최대로 높이기 위해 기본 디지털 PCR 분석 전에 다양한 희석으로 검체를 검사합니다
  • 반응 혼합물을 준비하기 전에 모든 구성 요소를 완전히 해동하고 구성 요소를 완전히 혼합하여 용액을 균일하게 만들고 가볍게 원심 분리하여 유출되지 않도록 합니다.
  • 마스터 혼합물을 검체, 프라이머, RNAase가 없는 물 및 제한 효소와 결합합니다(사용하는 경우)
  • 멸균 피펫 팁 사용
  • 반응 혼합물을 나노플레이트에 피펫합니다. 플레이트의 검체 이동 및 다운스트림 운송 중 dPCR 나노플레이트의 웰에 기포가 유입되지 않도록 합니다
  • 증발 및 오염을 방지하기 위해 롤러를 사용하여 호일로 나노플레이트를 조심스럽게 밀봉합니다
  • dPCR 반응 혼합물이 투입 웰의 바닥에 머물도록 플레이트의 측면 가장자리만 잡고 흔들거나 돌리지 않은 상태로 나노플레이트를 dPCR 기기로 운송합니다
  • 소프트웨어 설정 및 dPCR 실행 시작

증폭 팁

세 가지 dPCR 반응 단계 중 두 번째 단계는 증폭을 통해 dPCR 프로토콜을 실행하는 것입니다. 이 단계에서 각 웰의 반응 혼합물은 수천 개의 개별 반응으로 분리됩니다. PCR 반응은 서모사이클러에서 수행됩니다. 템플릿 물질이 분획 내에 있는 경우 이미징 작업 중 양성 형광 신호가 감지됩니다. 이미지는 전용 소프트웨어에서 처리합니다. 현재 플레이트 상태는 일반적으로 dPCR 기기 자체에서 또는 연결된 소프트웨어 제품군을 사용하여 모니터링할 수 있습니다.

최적의 증폭 조건 및 PCR 효율성을 달성하기 위한 팁은 다음과 같습니다.

  • 어닐링 온도 – dPCR 분석 특이성에 영향을 미칠 수 있으며 일반적으로 55~65°C 사이로 설정됩니다. 최적의 어닐링 온도는 양성 분획과 음성 분획 사이에서 최대 분리가 달성될 때 얻어집니다. 어닐링 온도를 높이면 양의 신호와 배경 노이즈 사이의 분리를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다
  • 증폭 주기 – 양성 신호와 배경 노이즈를 충분한 분리하기 위해 40회의 증폭 주기를 실행하는 것이 좋습니다.경우에 따라 최적의 성능을 달성하기 위해 열 사이클 수를 늘려야 할 수도 있습니다

디지털 PCR 데이터 분석

3개의 dPCR 반응 단계 중 마지막 단계에서는 디지털 PCR 데이터 분석이 포아송 통계에 기반한 절대 정량화를 통해 수행됩니다.

QIAcuity Software Suite은 절대 정량화, 돌연변이 검출, 유전체 편집, 복제수 변이 또는 유전자 발현 등 응용 분야의 목표에 따라 디지털 PCR 데이터 분석을 수행할 수 있습니다. 절대 정량화 분석(일차 수준 분석)에서 소프트웨어는 선택한 웰의 농도 다이어그램과 양성 및 음성 분획 보기를 생성합니다. 열 지도 보기는 기준 채널 옆에 표적 채널을 표시합니다. 히스토그램 및 산점도를 사용하여 임계값 설정을 변경하고 결과를 다시 계산할 수 있습니다. QIAcuity Software Suite에서 플레이트의 분석 결과에 대한 보고서를 생성할 수 있습니다. 절대 정량화는 모든 후속 계산 및 이차 분석(예: 돌연변이 검출 분석, 유전자 발현 분석, 복제수 변이 분석 등)을 위한 전제 조건입니다.

디지털 PCR 데이터 분석을 위한 팁: 

  • 음성 분획 클러스터 바로 위에 양성 또는 음성으로 파티션을 분류하도록 임계값을 설정합니다
  • 임계값을 설정하는 데 도움이 되도록 음성 분획만 있는 주형 없는 대조물질(Non-Template Control, NTC) 검체를 사용하고 모든 웰에 대한 검사도 수행합니다
  • 일부 분획이 잘못 분류되지 않도록 개별 웰의 형광 진폭을 NTC보다 약간 높거나 낮게 설정할 수 있습니다
  • 합의된 값은 없지만 일반적으로 양성 분획 수가 2를 초과하면 반응이 양성인 것으로 간주됩니다
  • 웰 간 및 배치 간 가변성을 해결하려면 부피 정밀도 계수(Volume Precision Factor, VPF)를 사용하여 각 웰의 정확한 부피를 정의하고 소프트웨어의 농도 계산에 계수를 적용합니다
디지털 PCR 데이터의 예
QIAcuity 디지털 PCR 응용 분야 가이드
dPCR 응용 분야를 위한 실험 설정 및 데이터 분석 수행에 대한 자세한 내용을 확인할 수 있습니다.
가이드 받기

디지털 MIQE(dMIQE) 지침

디지털 PCR 실험 간행물을 위한 최소 정보(Minimum Information for Publication of Digital PCR Experiment, dMIQE) 지침은 처음에 qPCR 결과의 재현성과 비교 가능성을 보장하기 위해 작성되었으며 디지털 PCR 프로토콜에 적용되었습니다. 일련의 지침은 dPCR 접근 방식을 조율하고 다양한 실험실에서 쉽게 해석할 수 있는 의미 있는 결과를 제공하기 위해 dPCR 데이터를 생성하고 발표하는 데 사용됩니다.

dMIQE 지침에서는 방법과 결과를 재현하고 따르고 이해할 수 있도록 dPCR 실험 결과를 발표하는 데 필요한 항목 체크 리스트를 제공합니다. dMIQE 지침은 실험을 쉽게 복제하는 데 사용되며, 사용된 dPCR 기술에 관계없이 작업의 기술적 품질에 대한 분석과 검토에 중요한 정보를 제공합니다. 

더 읽어보기
Researchers optimizing dPCR assays and remaining compliant with dMIQE guidelines

dMIQE 지침 체크 리스트에 있는 항목은 dPCR 결과 발표 시 반드시 보고해야 합니다. 다음은 보고해야 하는 정보의 예입니다.

  • 분획당 평균 DNA 표적 복제수(λ)
  • 사용된 분획 수(이 값은 평균 DNA 표적 복사 수와 함께 dPCR 분석의 정밀도를 결정할 수 있음)
  • 템플릿 구조 정보(검체의 특성이 데이터 정확도와 신뢰도에 영향을 미칠 수 있음):
    • 개별 파티션 템플릿 유형: 유전체, 플라스미드 등
    • 출처: 유기체, 조직, 세포, 식품, 식물 등
    • 치료: 제한 분해, 초음파 처리, 사전 증폭, 희석, 없음
  • 개별 파티션 볼륨(이 볼륨은 dPCR 플랫폼에 따라 다를 수 있음)
  • 총 반응 용량(분획 수에 분획 용량을 곱하여 계산할 수 있음)
  • 사용되는 대조물질 유형
  • 양성 및 음성 실험 데이터의 대표적인 증폭 플롯 또는 종말점 형광 값
  • 실험적 분산의 예(실험의 불확실성을 더 정확하게 포착하기 위해 다양한 생물학적 복제본을 사용하는 것이 바람직함)
  • 기타
Whitepaper: 불용체적(dead volume) 이해 및 해결
불용체적(dead volume)은 dMIQE 지침에서 중요한 매개변수입니다. 높은 dPCR 민감도를 위해 불용체적(dead volume)의 한계를 해결하는 방법을 자세히 알아보세요. 
지금 다운로드

qPCR에서 dPCR로 분석을 전송하고 최적화하는 방법

real-time PCR 분석  설계를 위한 고려 사항은 디지털 PCR 프로토콜에도 적용됩니다. 만족스러운 qPCR 결과를 생성하는 분석은 dPCR에서도 성공적으로 수행됩니다. 처음에는 검증된 qPCR 방법의 농도를 사용하는 것이 좋지만 양성 분획의 종말점 형광 값을 개선해야 하는 경우 프라이머/프로브 농도 구배를 실행하는 것이 좋습니다. 위 섹션에 설명된 대로 형광단의 호환성과 dPCR에 대한 권장 열 순환 조건 및 프라이머/프로브 농도에도 주의를 기울여야 합니다.
dPCR 분석 최적화를 위한 매개변수
상태 영향 받는 항목 범위
어닐링 온도 •특이성
•양성 및 음성 분획 분리
•분석 아티팩트		 •이론 또는 작동 Ta +/– 2.5ºC
프라이머/프로브 농도 • 양성 및 음성 분획 분리
(양성 신호 증가 또는 음성 신호 감소)		 •0.8µm 프라이머, 0.4µm 프로브(시작점)
열 순환 단계 •중간 분획 신호 제거 •2 또는 3(72ºC 신장 포함)
열 주기 반복 횟수 •중간 분획 신호 제거 •30~60회 반복

그러나 새 분석을 온보딩할 때는 성능을 평가하기 위해 항상 초기 예비 검사를 수행하는 것이 좋습니다. 또한 적절한 배경 기질에서 잘 특성화된 대표적인 대조물질을 사용하는 것이 좋습니다. 성능이 최적이 아닌 경우 분석 정확도를 보장하도록 분석을 최적화해야 합니다. 이 경우 재현성을 위해 최적화 프로세스의 세부 정보를 보고하는 것이 매우 중요합니다.

최적 상태가 아닌 분석을 신속하게 최적화하기 위해서는 어닐링 단계 중 온도 구배를 실행하여 QIAcuity 마스터 혼합물을 임의의 real-time PCR 기기에서 실행할 수도 있습니다.

Whitepaper: qPCR 및 dPCR의 정확도 및 민감도
qPCR과 dPCR의 성능을 비교하는 데이터를 살펴보고 응용 분야에 적합한 방법을 정보에 입각하여 결정할 수 있습니다.
더 읽어보기

디지털 PCR 문제 해결

dPCR 실험은 qPCR이나 일반 또는 기존 PCR과 유사한 문제의 영향을 받을 수 있습니다. 그러나 디지털 PCR 분석을 수행할 때는 몇 가지 특정 문제가 발생할 수 있습니다. 아래 표는 일반적인 dPCR 프로토콜에서 흔히 발생하는 문제에 대한 dPCR 문제 해결 가이드 역할을 합니다. 또한 가능한 원인과 전문가의 권장 사항이 간략하게 설명되어 있습니다.

문제 가능한 원인 권장 사항
음성 분획 없음 주형 없는 대조물질(Non-Template Control, NTC) 웰에 음성 분획이 있는 경우:
검체의 목표 농도가 너무 높음		 일련의 희석을 실행하여 최적의 DNA 투입량을 결정합니다
NTC 웰에 양성 분획만 있는 경우:
프로브 원액의 장기 보관 불량
또는 중합효소에 의한 조기 프로브
절단으로 인한 프로브 가수분해		 프로브를 재정렬하고 새 프로브 원액을 만들거나
내부 분석 상호 작용을 식별하고 dPCR 분석 구성 요소를
재설계하여 결합 및 절단을 줄입니다
양성 분획 없음 제한 효소가 표적 서열 내에서
절단되었을 수 있음		 다른 제한 효소 및 분해되지 않은 DNA로
분해된 DNA에 대한 dPCR 분석을 검사합니다
표적 서열이 이차 구조의 일부이거나
루프, 반복, 높은 G/C 함량을
포함함		 다른 표적으로 재설계합니다. 제한 효소를 사용하여
투입된 DNA를 단편화합니다(표적 서열 자체를 절단하지 않음)
증폭 조건이 최적이 아님 어닐링/연장 온도 구배를 수행하여 최적의 디지털 PCR
프로토콜 온도를 결정하고, 물리적 매개변수를
조정합니다(신장 시간, 등)
부분적 dPCR 억제 핵산 정제 방법/키트를 변경합니다. 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)과 같은 촉진자를
추가하는 것이 좋습니다
프라이머 또는 프로브가 예상한
표적 영역과 일치하지 않음		 dPCR 분석 설계 또는 프라이머/프로브 합성 중 오류가
발생하지 않았는지 확인합니다
NTC 웰에서 양성 신호 발생 시약의 템플릿/앰플리콘
오염		 피펫, 팁 상자, 벤치 상부를 5~10%의 표백제로 닦습니다.
별도의 방에서 검체를 준비하고 dPCR을 수행합니다.
적절한 개인 보호 장비를 착용합니다.
열에 불안정한 우라실 N-글리코실라아제(UNG)와 함께 dUTP가 포함된 혼합물은
오염된 PCR 생성물에서 발생하는 위양성 수를 줄일 수 있지만
템플릿에서 발생하는 오염 물질에는 영향을 미치지 않습니다
양성 수가 적음 DNA가 제대로 정제되지 않음 정제된 DNA만 사용하고 대체 방법/정제 키트를 사용해 보십시오
검체 또는 나노플레이트 로드가 적절하지 않음 검체 DNA에 과잉 로드 또는 과소 로드하지 않도록 합니다.
조심스럽게 피펫팅하고 전체 dPCR 혼합물을 나노플레이트로 옮겼는지 확인합니다.
투입 웰 바닥에 검체가 남아 있는지 확인합니다
잘못된 프라이머 농도 권장 프라이머 및 프로브 농도를 사용합니다
증폭 중 나노플레이트에서
증발		 롤러와 호일을 사용하여 나노플레이트를 조심스럽게 밀봉합니다(가장자리 주변 포함).
입력 웰에 기포가 있음. 조심스럽게 피펫하고 측면 가장자리만
잡고 나노플레이트를 운반합니다. 나노플레이트를 떨어뜨리거나 뒤집지 마십시오
교란 또는 나노플레이트로의 부적절한
검체 이동(이로 인해 일부 검체가
입력 웰 바닥에서 수집되지 않음)
양성 분획과 음성 분획이 명확하게
구분되지 않음		 최적이 아닌 증폭 조건 주기 수를 늘리고(50주기 이하) 램프 속도를. 신장 시간은 2분,
변성 시간은 1분으로 늘립니다(특히 더 긴 앰플리콘에 중요).
최적의 DNA 투입량을 결정하기 위해 일련의 희석을 수행합니다
EvaGreen으로 작업할 때
양성 분획과 음성 분획을
분리할 수 없음		 프라이머 또는 DNA 시작물질이
과다함		 권장 농도의 프라이머를 사용하십시오. 시작물질을 과잉 로드하지 않도록
합니다
단편 길이가 너무 김 제한 분해로 조각 길이를 균질화합니다
배경의 ‘비(Rain)’ 모양
(양성 또는 음성 모집단에
속하지 않는 분획)		 비특이적 결합 프라이머를 과잉 로드하지 않도록 합니다.
어닐링 온도를 높이고, 주기 수를 줄이고, 확장 및 어닐링 시간을 줄이십시오.
시약에 불순물이 없는지 확인합니다
표적 접근성이 좋지 않음 제한 분해(표적 서열 절단 방지) 또는 초음파 분해를
사용합니다. RNA 이차 구조를 다루려면 표적 위치를 변경하거나
더 따뜻한 온도에서 역전사를 수행하십시오
일부 분획의 부분 억제로 인해
PCR 시작이 늦음		 로드되는 검체의 양을 줄입니다. 검체를 더 희석하거나
핵산 정제에 사용하는 방법이나 키트를 변경합니다
노이즈가 나타남(임계값을 초과한
음성 포인트 클러스터)		 고체 또는 기포로 된 오염 물질 나노플레이트 준비 시 각별히 주의합니다.
가능한 경우 결과를 이해하기 위해 수동으로 결과를 검사합니다
기기에서 광학 문제 발생 dPCR 시스템에 광학 안정성이 높은 우수한 광학
기술이 적용되었는지 확인합니다
예기치 않은 추가 클러스터
등장		 관심 표적의 서열
변이		 예상치 않은 클러스터가 바람직하지 않은 경우: 임계값을 클러스터보다 높게
설정하여 정량화에서 제외하고, 어닐링 온도를 높여 특이성을 개선하고,
제한 효소로 분해하여 비특이적 표적을
절단하고, 프라이머 또는 프로브를 다시 설계하여
비표적 서열에 대한 상보성을 줄입니다. 클러스터의 기능이 잠재적으로 동일한 경우
두 클러스터가 하나의 클러스터로 병합되도록 어닐링 온도를 낮추는 것이
좋습니다.
일부 웰에서 농도가 측정되지
않음		 반응 혼합물 조합 또는 검체
준비 중 문제 발생		 dPCR 분석이 올바르게 설정되어 있고 DNA 투입 및 순도가
충분한지 확인합니다.
운송 중 나노플레이트 취급
불량(흔들림, 떨어짐)		 검체 준비 및 dPCR 반응 혼합물을 나노플레이트에 피펫팅할 때
측면 가장자리만 잡고 나노플레이트를 취급하고,
dPCR 시스템에 로드하기 전에 뒤집거나 흔들거나 떨어뜨리지 않도록 각별히 주의합니다.
가능한 경우 소프트웨어에서 수동으로 임계값을 설정하여
특정 농도를 계산합니다
플레이트가 적절하게 밀봉되지 않음
(측면 증발)		 롤러를 사용하여 호일로 플레이트를 조심스럽게 밀봉합니다
측정 농도가 너무 낮음 dPCR 분석 설계가 적절하지 않음 온도 구배 실험을 실행하여 dPCR 분석이 최적의 조건에서 실행되고 있는지
확인합니다. 형광단이 G 잔류물에 결합되지 않았는지 확인하고
권장 농도의 프라이머 및 프로브를 추가합니다
표적 접근성이 좋지 않음 제한 분해(표적 서열 절단 방지) 또는 초음파
처리를 사용합니다
검체 내 PCR 억제제 존재 핵산 정제 방법/키트를 변경합니다. 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)과 같은 촉진자를
추가합니다
대형 오류 표시줄(일관되지 않은 결과) 반응 혼합물이 적절하게 혼합되지 않음 반응 혼합물을 철저히 혼합합니다
열 순환기의 온도 균일성
문제		 처음 5 사이클(cycle) 동안 변성 온도를 94°C에서
96°C로 높입니다

dPCR 최적화를 통한 추가 지원

참고 문헌

Iowa Institute of Human Genetics – Droplet Digital PCR (accessed January 20, 2023)

Lindner L et al. Reliable and robust droplet digital PCR (ddPCR) and RT-ddPCR protocols for mouse studies. Methods. 2021; 191(4):95-106.

Pecoraro S et al. Overview and recommendations for the application of digital PCR. EUR 29673 EN, Publications Office of the European Union, Luxembourg, 2019

QIAGEN. QIAcuity User Manual Extension. June 2021.

Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 2012; 113(5):1014-1026.

Sidstedt M, Rådström P, Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS – mechanisms and solutions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2020; 412:2009-2023. 

The dMIQE Group and Hugget JF. The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020. 2020; Clin Chem 66(8):1012-1029.