Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit

6xHisタグ付きタンパク質の中規模自動精製用

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Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit (4)

Cat. No. / ID:  969261

4 x 96 6xHisタグ付きタンパク質調製用:4 QIAfilter 96プレート、4 TurboFilter 96プレート、1 x 100 ml Ni-NTA Superflow
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$2,009.00
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Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kitは分子生物学的アプリケーション用であり、疾病の診断、予防、あるいは治療に使用することはできません。

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Features

  • ウェルあたり最大2 mgのタンパク質を完全自動精製
  • クロスコンタミネーションのない高純度タンパク質
  • 天然または変性条件下での精製

Product Details

Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kitでは、96サンプルから最大300 µgの組み換えタンパク質を並行して自動精製できます(標準プロトコール、1サンプルあたり5 mlの培養量)。澄明な細菌細胞溶解物は、BioRobotワークステーションによって、Ni-NTA Superflowを事前にロードしたフィルタープレート上を流れます。このユニークな96ウェル金属キレートアフィニティークロマトグラフィーモジュールは、Hisタグ付きタンパク質を強力かつ選択的に結合します。天然または変性条件下での精製用に、すぐに使えるプロトコールが用意されています。

Performance

自動化手順で、より大量のタンパク質を必要とするお客様のニーズに応えて、QIAGENは、Ni-NTA Superflow 96 BioRobotのプロトコールを改良し、より大量の培養量の処理と、ウェルあたり最大2 mgのHisタグ付きタンパク質の精製を可能にしました。この手順で使用するNi-NTA Superflow樹脂の量をウェルあたり200 µl に増やし、溶解緩衝液の製剤設計を最適化することにより、最大25 ml(天然条件下での精製)または15 ml(変性条件下での精製)の培養物を処理できます(高収量プロトコール)。細胞培養を24ウェルブロックに移し、処理します。これに対応してバイオマスが増加し、ウェルあたりの純粋なHisタグ付きタンパク質の収量が増加します(表と図  ウェルあたりのHisタグ付きタンパク質のミリグラム量を参照)。これによって、同じバッチのタンパク質に対して複数のアッセイを実行し、必要なタンパク質調製物の総量を削減することができます。図  自動発現クローンスクリーニングも参照。シングルステップ精製により、幅広い収量の高純度タンパク質が得られ、大きなタンパク質複合体の精製も可能です。

改良したNi-NTA Superflow 96 BioRobotプロトコールを用いたHisタグ付きタンパク質の収量
Hisタグ付きタンパク質 ウェルあたりの総収量
(µg)*
タンパク質の濃度
(mg/ml)†
緑色蛍光タンパク質 4000 6.0
T7 RNAポリメラーゼ 1000 1.4
GroES 300 0.4
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ 2400 4.4
GroEL 740 1.0
腫瘍壊死因子 α 1600 2.5
GroES/GroEL 1200 1.5
Cpn-10 170 0.3
* 2つの550 µl溶出画分で得られた収量(6回の独立した精製の平均)。タンパク質の80%は最初の550 µlに溶出します。
†最初の550 µl溶出画分のタンパク質濃度

 

See figures

Principle

Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kitを含む QIAexpress Ni-NTAタンパク質精製システムは、6個以上のヒスチジン残基のアフィニティタグを含むタンパク質に対する特許取得済みのNi-NTA(ニッケル-ニトリロ三酢酸)樹脂の優れた選択性に基づいています。この技術により、天然または変性条件下で、あらゆる発現系から、ほぼすべてのHisタグ付きタンパク質をワンステップ精製できます。ニッケルイオンに対して4つのキレート部位を持つNTAは、金属イオンとの相互作用に利用できる部位が3つしかない金属キレート精製システムよりもしっかりとニッケルに結合します。余剰なキレート部位がニッケルイオンの浸出を防ぐため、他の金属キレート精製システムを使用した場合よりも結合能が高く、高純度のタンパク質調製物が得られます。QIAexpressシステムを使用すると、バキュロウイルス、哺乳類細胞、酵母、細菌など、あらゆる発現系からHisタグ付きタンパク質を精製できます。(図  Ni-NTAタンパク質精製システムによるタンパク質の精製を参照)。

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Procedure

Hisタグ付きタンパク質の精製は、細胞溶解、結合、洗浄、溶出の4段階で構成されており、Ni-NTA Superflow BioRobot Kitの基礎となっています(図  Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kitを参照)。QIAexpressシステムを用いる組み換えタンパク質の精製は、タンパク質や6xHisタグの3次元構造に依存しません。これにより、希釈溶液や粗溶解物から、天然または変性条件下で、タンパク質をワンステップ精製できます。受容体、膜タンパク質、封入体を形成するタンパク質の効率的な可溶化と精製には、強力な変性剤や洗浄剤を使用できます。非特異的に結合する汚染物質を効率的に除去できる試薬を洗浄バッファーに含めることができます(表を参照)。精製したタンパク質は、競合剤として100~250 mMのイミダゾールを加えるか、pHを下げることにより、穏やかな条件下で溶出します。

Ni-NTA Superflow 96 BioRobot KitはBioRobot 3000、8000、9600ワークステーション用です。

His/Ni-NTA相互作用に対応する試薬
変性剤界面活性剤還元剤その他長期保存用
6 M Gu·HCl2% Triton X-10020 mM β-ME50%グリセロール4 M MgCl2最大30%エタノール
8 M 尿素2% Tween 2010 mM DTT20%エタノール5 mM CaCl2または100 mM NaOH
 1% CHAPS20 mM TCEP20 mMイミダゾール2 M NaCl 

 

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Applications

NQIAexpress Ni-NTAタンパク質精製システムは、以下を含む多くのアプリケーションに適したタンパク質を高い信頼性でワンステップ精製します。

  • 構造および機能研究
  • 三次元構造決定のための結晶化
  • タンパク質-タンパク質およびタンパク質-DNA相互作用を含むアッセイ
  • 抗体を産生するための免疫付与

Supporting data and figures

Specifications

FeaturesSpecifications
Applicationsプロテオミクス
Yield15 µg~4 mg
Start material細胞溶解物
Tag6xHisタグ
Bead size60~160 µm
特殊機能クロスコンタミネーションフリー
Scale中規模
Number of preps per runランあたり1~96サンプル
Processing自動
Support/matrixSuperflow
Binding capacity5~20 mg/ml

Resources

MSDS (1)
Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.
キットハンドブック (2)
For Automated medium and large-scale purification of 6xHis-tagged proteins
Supplementary Protocols (2)
The two protocols given below are for the use of the Ni-NTA Superflow 96 BioRobot® Kit in manual procedures. The kit has been specially designed and optimized for automated 6xHis-tagged protein purification on QIAGEN® BioRobot Systems. For more details of the advantages of BioRobot Systems see the Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit Handbook supplied with the kit or contact one of the QIAGEN Technical Service Departments or local distributors listed on the last page of the handbook.
The following protocols have been designed for the use of Ni-NTA Superflow Columns on the QIAvac 6S vacuum manifold or in gravity-flow applications on the QIArack. Up to 15 mg 6xHistagged protein can be purified per column from cleared lysate derived from up to 1 liter of (E. coli) bacterial culture.
Safety Data Sheets (1)
Certificates of Analysis (1)
Kit Handbooks (2)
For Automated medium and large-scale purification of 6xHis-tagged proteins

FAQ

What are your recommendations for PCR template preparation for use with the EasyXpress Insect Kit II?

We recommend to use the EasyXpress Linear Template Kit Plus to generate PCR products optimized for use in protein expression with the EasyXpress Insect Kit II.

This kit uses specially designed primers to amplify coding DNA sequence and supplement it with regulatory elements required for optimal transcription and translation in cell-free expression systems. In addition, specially designed 5' untranslated regions (UTRs) on the sense adapter primer sequences reduce the formation of secondary structure in the translation initiation region, one of the commonest causes of low expression rates. A His-or Strep-tag II can be added to either terminus, greatly simplifying protein purification and detection after expression.

FAQ ID -1221
What are the features and benefits of the QIAexpress 6xHis Tag System?

FEATURES BENEFITS
The interaction of the 6xHis tag with Ni-NTA matrices is conformation independent One-step purification can be carried out under native or denaturing conditions
Mild elution conditions can be used Binding, washing, and elution are highly reproducible, and have no effect on protein structure. Pure protein products are ready for direct use in downstream applications
The 6xHis tag is much smaller than other commonly used tags 6xHis tags can be used in any expression system. The Tag does not interfere with the structure and function of the recombinant protein
The 6xHis tag is uncharged at physiological pH The 6xHis tag does not interfere with secretion
The 6xHis tag is poorly immunogenic The recombinant protein can be used without prior removal of the tag as an antigen to generate antibodies against the protein of interest
Using Factor Xa Protease, 6xHis tag can be easily and efficiently removed The detagged protein can be used for crystallographical or NMR studies where removal of the 6xHis tag may be preferred
Some QIAexpress vectors feature a 6xHis-dihydrofolate reductase tag (6xHis-DHFR tag) Small peptides fused to the 6xHis DHFR tag are stabilized while being expressed. The 6xHis-DHFR tag is not highly immunogenic in mouse and rat, so that peptides fused to the tag can be used directly for immunizations or epitope mapping

 

FAQ ID -193
Can Ni-NTA resins be used to purify protein with an internal His-tag?
Yes, Ni-NTA Agarose and Superflow will bind a 6xHis-tag whether it is located internally or at the C- or N-teminal end of the protein. Note that the His-tag must be exposed for binding at the surface of the protein to allow for efficient purification under native conditions.
FAQ ID -496
Do you have a protocol for manual purification of 6xHis-tagged proteins expressed in E. coli using Ni-NTA Superflow?