ナノプレートdPCRアプリケーション

貴重なサンプルを取り扱っている場合、希少な突然変異を解析している場合や、阻害物質だらけのサンプルを研究している場合、ナノプレートdPCRなら正確で再現性の高いデータを得ることができます。ワークフローは、迅速で自動化され、ばらつきを抑えて一貫性を向上させるだけでなく、シンプルなため、使用するためトレーニングをほとんど必要としません。

デジタルPCR、特にQIAcuityのナノプレートdPCRは、研究者の探求する課題とその答えを根本から変えていくことで研究に革命をもたらし、以前はqPCRやその他のdPCR技術の制限によって滞っていたアプリケーションを再び活発化します。以下で、特定のアプリケーションを使って技術を生かす方法について説明します。

コピー数多型（CNV）解析では、個人のゲノムの特定の遺伝子のコピー数を測定します。遺伝子はゲノムごとに2つのコピーが存在することが知られています。しかし、この遺伝子は、場合によってはより多く存在することがあります。遺伝子増幅（がん遺伝子を活性化する）と欠失（腫瘍抑制遺伝子を不活性化する）は、点突然変異、転座、逆位などのゲノム変化に加えて、がん関連遺伝子に影響を与える重要なコピー数変化（CNA）です。CNAの影響を受けるほとんどのがん関連遺伝子は、発がんとがんの進行に関与するがんシグナル伝達経路の重要な遺伝子と定義されています。 CNV は、遺伝的多様性（遺伝子座の欠失や重複）の重要な源であり、一般的な神経疾患や自己免疫疾患、遺伝子疾患、有害な薬物反応に関連する遺伝子の研究を可能にします。

ナノプレートdPCRをCNV解析に使用するメリット

• CNVの1.2倍未満の変化を検出し、約2時間で結果を出す
• 8.5Kナノプレートのもつマルチプレックス機能、または26Kナノプレートを使用した連続コピー数状態のさらに細かな区別により、dPCR CNV解析の経済性とスループットレベルが向上
• QIAcuity Software Suite でCNVを自動計算でき、オリジナルアッセイの設計も可能

感染症の罹患率の増加と集団発生によって、微生物、特に病原体の検出と解析の向上が強く求められるようになりました。公衆衛生と疫学において、病原体の 検出およびマイクロバイオームの解析のどちらにも、迅速性、高感度、正確さを兼ね備えた解析と絶対定量が不可欠です。デジタルPCRは迅速性があり高感度、高精度のメソッドで、病原体やマイクロバイオームの特定、検出、特徴付け、変化の監視に非常に有益です。dPCRの微生物検出が応用できる範囲は、食品中の病原体、薬剤耐性、微生物研究、 抗菌剤耐性遺伝子の調査、ウイルス/細菌の宿主関係と多岐にわたります。 

微生物検出におけるナノプレートdPCRのメリット

• 複雑なサンプルや阻害物質が高レベルのサンプルであっても微生物材料の正確な絶対定量が可能
• ナノプレート26Kでサンプル量が増え（最大28µl）、感度が向上して、他の商用アッセイの検出限界より少ない標的を検出
• オリジナル設計のアッセイのほか、カタログに掲載された700以上のアッセイの中から微生物標的（細菌、ウイルス、毒性因子、AMGなど）に合ったものを最大5アッセイ選択して組み合わせたマルチプレックス化が可能

デジタルPCRは、アデノ随伴ウイルスベクターゲノム滴定およびレンチウイルスベクターコピー数測定、CAR-T細胞療法の開発と製造など、幅広い遺伝子治療アプリケーションを可能にします。これは、患者の安全を確保しながら、効果的で再現性のある遺伝子治療を開発するのに重要です。

ウイルスの滴定測定

QIAcuity dPCRを使い、高速で全体的に高いスループットと拡張性を実現しながら、従来のddPCRメソッドと同じレベルの正確さと精度でウイルス滴定を定量できる方法をご紹介します。ウイルスベクターの溶解から残留DNAの定量、ベクターベノムの滴定 やゲノムの完全性の判定まで、卓越した正確さ、再現性、迅速性のあるワークフローを紹介します。

ナノプレートdPCRをAVVの滴定に使用するメリット

• 当社の専用キットを使用して効率的なカプシド溶解と残留DNAの除去を行えるため、一貫性があり確実な最終の滴定測定が可能
• プロトコールが1つしかなく、マニュアルのステップ数が最小限で、ハンズオン時間がわずか10分のため、エラーが減って実行が簡単
• 最大10の単一標的アッセイを異なる染色の組み合わせでマルチプレックス化できるため、高い精度と柔軟性を実現になり、オプションでは 目的の遺伝子（GOI）アッセイで5プレックス能力まで拡張可能
• 高機能なQIAcuityソフトウェアによって同時に最大5つの標的を使用できるため、ゲノムの完全性の精密な評価が可能

マイコプラズマは、バイオ医薬品産業においては細胞株に由来するバイオ製品の汚染菌です。マイコプラズマは、供給源の細胞株（細胞基質）自体が汚染された結果、または生産の過程で偶発的に持ち込まれた結果として細胞培養に出現します。汚染リスクのガイドライン、バイオ医薬製品の製造におけるマイコプラズマの安全性に関する技術論文が複数ご覧いただけます。

デジタルPCRは細胞培養やその他の細胞培養由来の生物製剤の汚染検出に使用できます。例えば、QIAcuityマイコプラズマ定量キットはRT-dPCRキットで、メソッドの感度を向上させ、rRNAおよびDNAの検出を可能にします。内部増幅コントロールによりPCR阻害物質による偽陰性、不適切なRNA抽出、不適切なRT反応が回避できます。プローブベースのアッセイで127種類の異なるマイコプラズマ種を定量、検出することが可能です。

ナノプレートdPCRをマイコプラズマの検出に使用するメリット

• 準拠性：欧州、米国、日本の薬局方に準拠したマイコプラズマ試験のためのNAT（Nucleic Acid Technique）ワークフロー
• 迅速性：時間のかかるマイコプラズマ培養が不要
• 高感度：rRNAの検出において、単一のバクテリア細胞内に複数のコピーが存在するため、DNAのみ使用した場合より高い感度が得られます （10CFU/mL未満を検出）。アッセイはRTステップを省略してもDNAの検出が可能で、高い柔軟性があります。
• 検証済み：ワークフローは包括的な検証レポートの一部として、広範囲にわたって試験されているため、ご自身による検証作業の手間が軽減されます。
• 施設内検証用、または 生体のマイコプラズマを侵入させることのない陽性コントロールとして使用できる10種類のマイコプラズマ標準CFUキット

マイクロRNA（miRNA）は、2つ以上のサンプル間で複数または単一のmiRNAの発現レベルを同時に比較します。この解析は、がんなどの疾患のバイマーカとしてmiRNAの特定および定量に役立ち、正常な生物学的状態と疾患におけるmiRNA発現の役割について貴重な洞察が得られます。

miRNA発現解析におけるナノプレートdPCRのメリット

• dPCRの高い特異性により、密接な配列関連をもつmiRNAにおいて、単一ヌクレオチドの差異を識別
• 特に少量のテンプレート量での微細なmiRNA発現変化の絶対定量が可能

細胞集団をバルク解析する従来の方法と比較して、シングルセル解析は単一の細胞レベルでのデータ取得が可能であり、細胞の不均一性、生物学的機能、疾患のプロセスや発症機序の理解を深めるのに役立ちます。シングルセル解析に通常使用されるメソッドは、PCR、dPCR、次世代シークエンシング（NGS）を含め、目的の標的を検出する上で感度が不足している場合があります。

デジタルPCRは、費用対効果が良く、直感的で正確なdPCRプラットフォームで、高スループット、優れた検出感度と精度が得られるとして、最近シングルセル解析に使用する方法として注目を集めています。

ナノプレートdPCRをシングルセル解析に使用するメリット

• 精度が高く、物理的なパーティショニングがドロップレットより安定している
• プローブベースの検出は、最小限の最適化を施した1つのdPCR反応で、最大5つ標的をマルチプレックス化できる
• 正確な結果が得られるため、少量の標的や多重コピーの標的であっても単一の細胞レベルでの解析が可能になる

次世代シークエンシング用のライブラリ定量は、フローセルを最大効率で使用するのに不可欠な手順です。ライブラリの定量が不正確で、その後にNGSライブラリのロードが過度であったり不足していたりすると、データ出力と品質が損われます。デジタルPCRを使用してNGSライブラリプールの絶対濃度を測定することは、最適な収量を得てサンプルあたりのコストを削減するのに大いに役立ちます。

ナノプレートデジタルPCRをNGSライブラリ定量に使用するメリット

• 定期試験に適した、 増幅バイアスも標準バイアスもない、 増幅可能なライブラリの絶対定量が実施でき、 結果が2時間で得られる
• すべてのタイプのIlluminaライブラリを 1つのアッセイでカバーしたライブラリプーリングに 高い再現性と優れた均一性が期待できる