Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit

Pour la purification automatisée à échelle moyenne des protéines marquées à l’hexahistidine (6xHis)

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Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit (4)

Cat. No. / ID:  969261

Pour 4 × 96 préparations de protéines marquées à l’hexahistidine (6xHis) : 4 QIAfilter 96 plaques, 4 TurboFilter 96 plaques, Ni-NTA Superflow 1 × 100 ml
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Le Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit est destiné aux applications de biologie moléculaire. Ce produit n’est pas conçu pour le diagnostic, la prévention ou le traitement des maladies.

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Features

  • Purification entièrement automatisée de 2 mg maximum de protéine par puits
  • Protéines d’une grande pureté sans contamination croisée
  • Purification en conditions natives ou dénaturantes

Product Details

Le Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit permet la purification automatisée en parallèle de 300 µg maximum de protéines recombinantes provenant de 96 échantillons (protocole standard, 5 ml de volume de culture par échantillon). Les lysats cellulaires bactériens clarifiés traversent une plaque filtrante contenant le Ni-NTA Superflow que la BioRobot Workstation a préalablement chargé. Ce module unique de chromatographie d’affinité basée sur la chélation de métaux à 96 puits lie fortement et de façon sélective les protéines marquées à l’histidine (His). Des protocoles prêts à l’emploi sont proposés pour la purification en conditions natives ou dénaturantes.

Performance

Ses clients ayant besoin de quantités plus importantes de protéines avec les procédures automatisées, QIAGEN a adapté le protocole Ni-NTA Superflow 96 BioRobot de façon à pouvoir traiter des volumes de culture plus importants et à effectuer la purification de 2 mg maximum de protéines marquées à l’histidine (His) par puits. L’augmentation de la quantité de résine Ni-NTA Superflow utilisée dans la procédure jusqu’à 200 µl par puits et l’optimisation de la formulation du tampon de lyse permettent de traiter jusqu’à 25 ml (purification en conditions natives) ou 15 ml (purification en conditions dénaturantes) de cultures (protocoles à haut débit). Les cultures cellulaires sont transférées dans des blocs de 24 puits pour être traitées. L’augmentation correspondante de la biomasse peut accroître le rendement par puits des protéines pures marquées à l’histidine (His) (voir le tableau et l’illustration  Milligrammes de protéines marquées à l’histidine (His) par puits), cela permet de réaliser plusieurs dosages sur un même lot de protéines et de réduire le nombre total de préparations de protéines nécessaires, voir également l’illustration  Criblage avec expression automatisée. La purification en une étape donne des protéines infiniment pures sur toute une gamme de rendements, et la purification de grands complexes de protéines est possible.

Rendements des protéines marquées à l’histidine (His) avec le protocole Ni-NTA Superflow 96 BioRobot adapté
Protéine marquée à l’histidine (His) Rendement total par puits
(µg)*
Concentration de protéines
(mg/ml)†
Protéine fluorescente verte 4 000 6,0
ARN polymérase T7 1 000 1,4
GroES 300 0,4
Chloramphénicol acétyltransférase 2 400 4,4
GroEL 740 1,0
Facteur de nécrose tumorale α 1 600 2,5
GroES/GroEL 1 200 1,5
Cpn-10 170 0,3
* Rendement obtenu dans deux fractions d’élution de 550 µl (moyenne de 6 purifications distinctes). 80 % des protéines sont éluées dans les 550 premiers µl.
† Concentration de protéines dans la première fraction d’élution de 550 µl.

 

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Principle

Le QIAexpress Ni-NTA Protein Purification System, associé au Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit, est basé sur la remarquable sélectivité de la résine brevetée Ni-NTA (Nickel-Acide nitrilotriacétique) pour les protéines contenant une étiquette d’affinité de six résidus d’histidine ou plus, le His-tag. Cette technologie permet une purification en une étape de quasiment toutes les protéines marquées à l’histidine à partir de n’importe quel système d’expression en conditions natives ou dénaturantes. Le NTA, qui présente quatre sites de chélation pour les ions nickel, lie le nickel plus étroitement que les systèmes de purification par chélation du métal, qui ne présentent que trois sites pour l’interaction avec les ions métalliques. Le site de chélation supplémentaire empêche la lixiviation des ions nickel et offre une plus grande capacité de liaison ainsi que des préparations des protéines d’une pureté supérieure à celle obtenue avec d’autres systèmes de purification par chélation du métal. Le système QIAexpress peut être utilisé pour purifier les protéines marquées à l’histidine à partir de n’importe quel système d’expression, y compris les baculovirus, les cellules de mammifères, les levures et les bactéries. (Voir l’illustration  Purification des protéines à l’aide du système de purification des protéines Ni-NTA.)

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Procedure

La purification des protéines marquées à l’histidine comprend 4 étapes : lyse cellulaire, liaison, lavage et élution, elle est nécessaire au Ni-NTA Superflow BioRobot Kit (voir l’illustration  Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit). La purification des protéines recombinantes avec le système QIAexpress ne dépend pas de la structure tridimensionnelle de la protéine ou du 6xHis-tag. Cela permet une purification des protéines en une étape en conditions natives ou dénaturantes, à partir de solutions diluées et de lysats bruts. Vous pouvez utiliser des dénaturants et des détergents puissants pour une solubilisation et une purification efficaces des récepteurs, des protéines membranaires et des protéines qui forment les corps d’inclusion. Les réactifs qui permettent d’éliminer correctement les contaminants de liaison non spécifique peuvent être inclus dans les tampons de lavage (voir le tableau ci-dessous). Les protéines purifiées sont éluées en conditions modérées par l’ajout de 100 à 250 mM d’imidazole comme concurrent ou par la réduction du pH.

Le Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit s’utilise avec les stations de travail BioRobot 3000, 8000 ou 9600. .

Réactifs compatibles avec l’interaction His/Ni-NTA
DénaturantsDétergentsAgents réducteursAutresSelsPour une conservation de longue durée
Gu HCl 6 MTriton X-100 2 %β-ME 20 mMGlycérol 50 %MgCl2 4 MJusqu’à 30 % d’éthanol
Urée 8 MTween 20 2 %DTT 10 mMÉthanol 20 %CaCl2 5 mMou NaOH 100 mM
 CHAPS 1 %TCEP 20 mMImidazole 20 mMNaCl 2 M 

 

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Applications

Le QIAexpress Ni-NTA Protein Purification System permet une purification fiable en une étape des protéines, adaptée à de nombreuses applications, notamment :

  • Étude des structures et des fonctionnements
  • Cristallisation pour la détermination d’une structure tridimensionnelle
  • Dosages impliquant des interactions protéine–protéine et protéine–ADN
  • Immunisation aux anticorps produits

Supporting data and figures

Specifications

FeaturesSpecifications
ApplicationsProtéomique
Yield15 µg à 4 mg
Start materialLysat cellulaire
Tag6xHis-tag
Bead size60 à 160 µm
Special featureSans contamination croisée
ScaleÉchelle moyenne
Number of preps per run1 à 96 échantillons par cycle
ProcessingAutomatisé
Support/matrixSuperflow
Binding capacity5 à 20 mg/ml

Resources

Safety Data Sheets (1)
Kit Handbooks (2)
For Automated medium and large-scale purification of 6xHis-tagged proteins
Supplementary Protocols (2)
The two protocols given below are for the use of the Ni-NTA Superflow 96 BioRobot® Kit in manual procedures. The kit has been specially designed and optimized for automated 6xHis-tagged protein purification on QIAGEN® BioRobot Systems. For more details of the advantages of BioRobot Systems see the Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit Handbook supplied with the kit or contact one of the QIAGEN Technical Service Departments or local distributors listed on the last page of the handbook.
The following protocols have been designed for the use of Ni-NTA Superflow Columns on the QIAvac 6S vacuum manifold or in gravity-flow applications on the QIArack. Up to 15 mg 6xHistagged protein can be purified per column from cleared lysate derived from up to 1 liter of (E. coli) bacterial culture.
Certificates of Analysis (1)

FAQ

What are your recommendations for PCR template preparation for use with the EasyXpress Insect Kit II?

We recommend to use the EasyXpress Linear Template Kit Plus to generate PCR products optimized for use in protein expression with the EasyXpress Insect Kit II.

This kit uses specially designed primers to amplify coding DNA sequence and supplement it with regulatory elements required for optimal transcription and translation in cell-free expression systems. In addition, specially designed 5' untranslated regions (UTRs) on the sense adapter primer sequences reduce the formation of secondary structure in the translation initiation region, one of the commonest causes of low expression rates. A His-or Strep-tag II can be added to either terminus, greatly simplifying protein purification and detection after expression.

FAQ ID -1221
What are the features and benefits of the QIAexpress 6xHis Tag System?

FEATURES BENEFITS
The interaction of the 6xHis tag with Ni-NTA matrices is conformation independent One-step purification can be carried out under native or denaturing conditions
Mild elution conditions can be used Binding, washing, and elution are highly reproducible, and have no effect on protein structure. Pure protein products are ready for direct use in downstream applications
The 6xHis tag is much smaller than other commonly used tags 6xHis tags can be used in any expression system. The Tag does not interfere with the structure and function of the recombinant protein
The 6xHis tag is uncharged at physiological pH The 6xHis tag does not interfere with secretion
The 6xHis tag is poorly immunogenic The recombinant protein can be used without prior removal of the tag as an antigen to generate antibodies against the protein of interest
Using Factor Xa Protease, 6xHis tag can be easily and efficiently removed The detagged protein can be used for crystallographical or NMR studies where removal of the 6xHis tag may be preferred
Some QIAexpress vectors feature a 6xHis-dihydrofolate reductase tag (6xHis-DHFR tag) Small peptides fused to the 6xHis DHFR tag are stabilized while being expressed. The 6xHis-DHFR tag is not highly immunogenic in mouse and rat, so that peptides fused to the tag can be used directly for immunizations or epitope mapping

 

FAQ ID -193
Can Ni-NTA resins be used to purify protein with an internal His-tag?
Yes, Ni-NTA Agarose and Superflow will bind a 6xHis-tag whether it is located internally or at the C- or N-teminal end of the protein. Note that the His-tag must be exposed for binding at the surface of the protein to allow for efficient purification under native conditions.
FAQ ID -496
Do you have a protocol for manual purification of 6xHis-tagged proteins expressed in E. coli using Ni-NTA Superflow?