DIGITALE PCR

Digitale Multiplex-PCR

Was ist digitale Multiplex-PCR?

Multiplexing bei der PCR ermöglicht den Nachweis von mehr als einem Target-Molekül oder mehr als einer Target-Sequenz in einer einzigen Reaktion. Multiplexing mit digitaler PCR (dPCR) kann durch Variation der Art der verwendeten Fluorophore erreicht werden. Bei dem traditionellen Mehrfarb-Multiplexing werden die Targets differenziert, indem eine Sonde je Target verwendet wird, die jeweils mit einem Farbstoff mit unterschiedlichem Emissionsspektrum konjugiert ist. Die meisten dPCR-Geräte ermöglichen den Nachweis verschiedener Fluorophore in mindestens zwei speziellen Detektionskanälen. Einige dPCR-Systeme ermöglichen ein 5-Farb-Multiplexing für die klare Unterscheidung von mehr Targets in derselben Reaktion.

Vorteile des dPCR-Multiplexings

Das Multiplexing bei der dPCR ist aufgrund der zahlreichen Vorteile des Multiplexings mit einem dPCR-System ein Thema von zunehmendem Interesse. Die Herangehensweise kann genutzt werden zur:

  • Analyse mehrerer Targets in einer einzigen Reaktion
  • Reduzierung technischer Fehler wie z. B. Ungenauigkeiten bei der Pipettierung
  • Erhöhung der Wahrscheinlichkeit eines Target-Nachweises
  • Reduzierung der benötigten Probenmenge für die Analyse
  • Bereitstellung einer direkten internen Kontrolle einer Einzelreaktion
  • Einsparung von Zeit und Reagenzien zur Senkung der Gesamtkosten

Multiplexing mit digitaler PCR ermöglicht mehrere Applikationen, die mit einfarbigen Assays nicht möglich oder nicht leicht durchzuführen sind. Einige dieser Analysen sind:

  • Kopienzahlvarianten: Paarung von Target- und Referenzgenen zur Bestimmung ihres Verhältnisses mit einer Duplex-Herangehensweise
  • Biallelische Variation von Einzelnukleotidvarianten oder kleinen Insertionen/Deletionen: Duplex-Herangehensweise mit zwei Hydrolysesonden, visualisiert anhand zweifarbiger Plots (1)
  • Genotypisierung: Zählen der Partitionszahlen für einzeln und doppelt positive Cluster (1)
Um die Vorzüge des Multiplexings mit der digitalen PCR vollständig nutzen zu können, ziehen Sie ein digitales PCR-System mit erweitertern Fähigkeiten zum Multiplexing in Betracht.

Ein digitales PCR-Gerät mit hoher Multiplexingleistung ermöglicht Ihnen die Analyse mehrerer Targets in einer Probe mit hoher Sensitivität und Reproduzierbarkeit. Das QIAcuity Digital PCR System beispielsweise ist in mehreren Konfigurationen verfügbar, um Ihren Anforderungen an Proben- und Target-Analyse gerecht zu werden.

Der Vorteil von digitaler Nanoplatten-PCR für Multiplex-Reaktionen

Die digitale Multiplex-PCR ist eine bevorzugte Herangehensweise, da die Methode flexibler, sensitiver und spezifischer ist als die Multiplex-qPCR. Multiplexing mit qPCR kann außerdem kompliziertere Methoden zur Berechnung absoluter Werte erfordern, und die Methode ist anfälliger für Interferenzen zwischen mehreren PCRs in einer Reaktion. 

Die digitale Nanoplatten-PCR bietet deutliche Vorzüge gegenüber anderen Arten der digitalen PCR, wie zum Beispiel kurze Laufzeiten, hohe Präzision und Sensitivität sowie Multiplexierungsfähigkeit. Da Nanoplatten auf einzelnen PCR-Reaktionen anstelle der Massenanalyse von Tropfen basieren, ist es möglich, seltene Targets zu finden (< 10–20 Kopien/Reaktion).

Die digitale Nanoplatten-PCR kann mit einer Vielzahl von Probenmatrizes verwendet und so bei mehr Stufen der AAV-Produktion eingesetzt werden. Das QIAcuity Digital PCR System ermöglicht auch unabhängigen Benutzern die parallele Durchführung mehrerer Assays, um ihre Produktivität zu steigern (29).

Hochdurchsatz- und Multiplexierungseigenschaften des QIAcuity Digital PCR System

  QIAcuity One  QIAcuity Four  QIAcuity Eight 

Detektionskanäle (Multiplexierung)

 2 oder 5  5  5 

Anzahl an einem Arbeitstag analysierter Proben 

Bis zu 384 

Bis zu 672 

Bis zu 1248 

Empfohlene Farbstoffe 

FAM; VIC, HEX; TAMRA; ROX; Cy5 

Wie sehen 5-plex-dPCR-Daten aus?

In der Abbildung links wurden 10 ng (A, oberes und unteres Panel) und 1 ng (B, oberes und unteres Panel) cDNA als Template-Einsatzmenge für die dPCR-Reaktion verwendet. Fünf Assay-Targets (ERBB2, EGFR, CDKN2A, KDR und CDK1) wurden in einer 5-plex-Reaktion in einer QIAcuity Nanoplate 8.5K mit 96 Wells auf dem QIAcuity One, 5-plex-System gemessen. Die Sonden wurden mit FAM, HEX, TAMRA, ROX oder Cy5 markiert. Die 2D-Streudiagramme zeigen eine klare Trennung der einzelnen Assays in einem Multiplex-Setup.

Sie haben weitere einführende Fragen zum dPCR-Multiplexing? Schauen Sie, ob unser QIAgenius sie beantworten kann:

Applikationen der Multiplex-dPCR

Multiplex dPCR-Assays können eine Vielzahl von digitalen PCR-Applikationen unterstützen. Diese reichen von der Zell- und Gentherapie über die Untersuchung von Lebensmittelbetrug und die AAV-Charakterisierung bis hin zum Nachweis von Mikroorganismen und einem Assay für Kopienzahlvariationen.
Multiplex-dPCR-Assays für Lebensmittel-Applikationen

Für digitale Multiplex-PCR-Assays gibt es zahlreiche Anwendungen in der Lebensmittelindustrie. In der regulatorischen Kontrolle und Qualitätssicherung für Lebensmittel können Multiplex-dPCR-Assays zur Identifizierung von Tierarten und zum Nachweis der Herkunft von Fleisch und Fleischprodukten, Fischarten und anderen Arten eingesetzt werden (2, 3). Mit dem digitalen PCR-Mulitplexing können Sie z. B. in einer einzigen Reaktion erfolgreich die Herkunft von Schwein, Kamel, Schaf, Esel, Ziege, Kuh und Huhn unterscheiden (2).

Multiplexing mittels dPCR könnte auch für GMO-Tests und die Quantifizierung von Transgenen anhand von Transgen-Endogen-Multiplex-PCR-Reaktionen verwendet werden (4, 27). In einer Studie wurden Duplex-PCR-Assays eingesetzt, um die Konzentrationen des MON810-Transgens mit denen eines HMG-Referenzgens in Futtermaisproben zu vergleichen. Der Multiplex-dPCR-Assay erreichte eine Sensitivität von fünf Target-DNA-Kopien mit besserer Wiederholbarkeit und Toleranz gegenüber Samenpulver-Inhibitoren als qPCR (5).

Lebensmittelbetrug ist eine weitere wesentliche Applikation des Multiplexings mit digitaler PCR, beispielsweise für den Nachweis von Zutaten tierischer Herkunft in verarbeiteten vegetarischen oder veganen Produkten. Ein Multiplex-dPCR-Assay auf Basis der Amplifikation des mitochondrialen Cytochrom-b-Gens, spezifisch für die meisten Tiere, sowie von Chloroplasten-DNA, spezifisch für die meisten Pflanzenarten, kann genutzt werden, um Zutaten tierischer Herkunft in vegetarischen Lebensmitteln nachzuweisen (6). 

Schließlich kann die dPCR auch zum Nachweis schwerwiegender, über Lebensmittel übertragener Krankheiten genutzt werden. Durch Multiplexing mittels digitaler PCR können Sie mikrobielle Pathogene wie E. coli, L. monoytogenes, S. aureus und S. enetrica gleichzeitig nachweisen (7).

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Multiplex-dPCR in einem Kopienzahlvariationsassay

In einem Kopienzahlvariationsassay kann das Multiplexing mittels dPCR genutzt werden, um anhand einer Duplex-Herangehensweise Target- und Referenzgene zu paaren und so deren Verhältnis zu ermitteln.

In einer Studie wurde Multiplexing mittels digitaler PCR erfolgreich eingesetzt, um gleichzeitig Genmutationen, Genfusionen und Genduplikationen nachzuweisen (8). Eine gleichzeitige Kopienzahlbeurteilung zweier wichtiger Onkogene bei Neuroblastom im Vergleich mit zwei normalen diploiden Referenzgenen war ebenfalls möglich und sparte wertvolle Probe ein. Die Multiplex-dPCR-Assays zeigten eine Spezifität und Sensitivität von 100 % für den gleichzeitigen Nachweis von Genmutationen, -fusion und -duplikation (9).

Ein weiteres Beispiel eines Kopienzahlvariationsassays mit dPCR-Multiplexierung umfasst die Genotypisierung von Proben spinaler Muskelatrophie (SMA). Die Studienautoren verwendeten Multiplexing mit digitaler PCR zur Quantifizierung der Kopienzahlen von SMN1 und SMN2 mit RPPH1 als interne Referenzgenkontrolle (10). Studien haben auch gezeigt, dass Multiplexing mittels digitaler PCR eingesetzt werden kann, um präzise und kostengünstig große Deletionen und Duplikationen im BRCA1-Gen (11) sowie MET- und HER2-Amplifikation bei nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC) nachzuweisen (28).

In einer weiteren Studie wurden Multiplex-dPCR-Assays für die Quantifizierung von Kopienzahlveränderungen (Copy Number Alterations, CNAs) in 15 genomischen DNA-Markern aus gefrorenen Proben von normalen Zellen und Zellen eines Plattenepithelzellkarzinoms (SCC) entwickelt und optimiert (12).

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Quantifizierung von Mutationen anhand von Multiplex-dPCR-Assays

Das Multiplexen von DNA-Targets mittels dPCR ist nützlich für die Quantifizierung somatischer Mutationen, die absolute Allelquantifizierung und den Nachweis seltener Mutationen. Studien zeigen, dass Multiplex-dPCR-Panels für die quantitative Analyse von onkogenen Mutationen in zellfreier DNA (cfDNA) (13) und Plasma verwendet werden können (14, 15).

Es liegen Nachweise vor, dass das Ermitteln optimaler Primer- und Sondenkonzentrationen und optimaler Elongationstemperaturen in Singleplex-Reaktionen die Mühe wert ist. Sie sollten auch auf die Kompatibilität von Primer-Sets und das Vorliegen von Regen bei Duplex-Reaktionen prüfen. Dann können Sie mit Kombinationen in komplexeren Multiplex-dPCR-Reaktionen fortfahren.

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Multiplexing mit dPCR für den Nachweis von Mikroorganismen

Multiplexing mit digitaler PCR wird häufig eingesetzt, um Mikroorganismenspezies nachzuweisen. Beispielsweise ermöglichen Multiplex-dPCR-Assays schnelle Tests auf bakterielle Pathogene, pilzliche Pathogene, virale Pathogene und verwandte Resistenzgene (16, 17, 18, 19, 20). Die berichteten Nachweissensitivitäten liegen bei nur 50 Kopieneinheiten pro ml, wobei eine Studie die Sensitivität der dPCR beim Nachweis von bakterieller DNA in Blut als 104-mal höher als die der qPCR berichtete (21).

In einer weiteren Publikation wurden Duplex-dPCR- und Duplex-qPCR-Assays entwickelt, um Cyanobakterien-Spezies in ihrer natürlichen Umgebung zu untersuchen. Die Autoren fanden heraus, dass die qPCR schnell und wirtschaftlich war, aber die dPCR eine höhere Genauigkeit, Präzision und Resistenz gegenüber PCR-Inhibition bot (22).

Inhibition und die Konkurrenz zwischen Targets sind eine wesentliche Herausforderung für die Multiplex-qPCR, besonders bei Umweltproben, in denen die Targets in geringen Mengen vorliegen und der Hintergrund aus Nicht-Target-DNA hoch ist. Multiplexing mit digitaler PCR ermöglicht nachweislich die genaue Quantifizierung von mindestens zwei Targets mit einem 1000-fachen Konzentrationsunterschied und liefert so eine praktikable Lösung für diese Grenzen der qPCR (22).

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Multiplex-dPCR-Assays in der Biopharma-Branche

In der Biopharma-Branche unterstützt dPCR-Multiplexing die Herstellungs- und Qualitätskontrollprozesse für monoklonale Antikörper (MABs), Impfstoffe, Zell- und Gentherapie sowie Biosimilars (23, 24, 25, 26). Multiplex-dPCR-Assays können zu mehreren Aspekten der Qualitätskontrolle beitragen, vom Nachweis von Kontaminanten bis zur Potenzquantifizierung. Die Methode macht eine effiziente Qualitätskontrolle möglich, da mehrere Kontaminanten gleichzeitig getestet werden können. 

Multiplexing mittels dPCR eignet sich gut für Applikationen, die eine genaue relative Quantifizierung eines Targets verglichen mit einem Haushaltsgen erfordern, oder wenn der Vektor, der entwickelt wird, mehrere therapeutische Gene und entweder ein Silencing-Gen oder eine Geneditierungsfunktion bereitstellt. Forschende, die mit Material von Patientinnen und Patienten arbeiten, können zudem mehr Informationen aus einer einzelnen Probe gewinnen, sodass wiederholte Probennahmen und menschliche Fehler sowie die Reagenzkosten pro Reaktion reduziert werden.

group of dividing cells

Überlegungen für die genaue Quantifizierung mittels digitaler Multiplex-PCR

  • Optimierung einzelner Assays: Validieren Sie Einzelreaktionen vor der dPCR-Multiplexierung (z. B. Überprüfung auf das Auftreten von Dimeren).
  • Bewertung von Primern und Sonden: Überprüfen Sie auf potenzielle Interaktionen zwischen Primern und Sonden.
  • Sorgfältige Auswahl von Farbstoffen: Wählen Sie die Farbstoffe für jeden Assay sorgfältig aus; wählen Sie für Targets mit niedriger Kopienzahl Farbstoffe mit hellem Fluorophor.
  • Überprüfung auf verknüpfte Targets: Untersuchen Sie das Potenzial für verknüpfte Targets oder Target-Korrelationen höherer Ordnung; verwenden Sie beispielsweise verknüpfungsbasierte Assays zur Messung der cis- versus trans-Konfiguration von Targets und potenzieller struktureller Umlagerungen.
  • Vermeidung von Kreuzhybridisierung: Designen Sie wenn möglich Sonde-zu-Target-Variationen, die zwei oder mehr Nukleotiddeletionen oder -insertionen umfassen, um Sonden-Fehlpaarungen zu vermeiden.
  • Minimierung von optischem Durchbluten: Tritt auf, wenn die Fluoreszenz eines Farbstoffs von mehr als einem Kanal erkannt wird; achten Sie wenn möglich darauf, dass Ihre konjugierten Farbstoffe zu den optischen Detektionssystemen passen, oder passen Sie die Signalverarbeitungsparameter in der Analysesoftware an.
  • Reduzieren von Regen: „Regen“ beschreibt die Untergruppe der Partitionen, deren Signal höher ist als das der negativen, aber niedriger als das der positiven Partitionen. Sie können Regen reduzieren, indem Sie Ihren Template-Typ, die Konformation, die Integrität, die Assayspezifität und das Vorliegen von Inhibitoren in der Reaktion überprüfen. Erwägen Sie, den Schwellenwert anders zu positionieren, um eine Beeinflussung der Quantifizierung durch Regen zu vermeiden.
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Loslegen mit der Multiplex-dPCR

Wenn Sie an der Durchführung digitaler Multiplex-PCR interessiert sind, erwägen Sie die Investition in ein dPCR-Gerät mit fortgeschrittenen Multiplexingfähigkeiten. Es sind auch zahlreiche für digitale Multiplex-PCR-Assays entwickelte dPCR-Kits und dPCR-Assays verfügbar, die sowohl Anfängern als auch Experten auf dem Gebiet des Multiplexings viele Vorteile bieten können.

  • Ihr Gerät für die digitale PCR – Es sind viele Arten von digitalen PCR-Systemen verfügbar, aber einige bieten mehr Multiplexingoptionen als andere. Das QIAcuity dPCR-System zum Beispiel bietet die Möglichkeit zum Multiplexing in bis zu 5 Kanälen (plus einem Referenzkanal) und stellt damit den einfachsten Weg dar, Multiplexing zu erreichen und Zeit und Reagenzien zu sparen:
Kanal  Anregung (nm)  Emission (nm)  Beispielhafte Fluorophore

Green

463–503 

518–548 

FAM 

Yellow 

514–535 

550–564 

HEX, VIC 

Orange 

543–565 

580–606 

TAMRA, ATTO 550 

Red 

570–596 

611–653 

ROX, Texas Red 

Crimson 

590–640 

654–692 

Cy5 

  • Ihre Mehrzweck-dPCR-Kits – Ziehen Sie den Einsatz von für Multiplex-Reaktionen entwickelten dPCR-Kits in Erwägung. Die QIAcuity Probe PCR Kits umfassen spezielle Master-Mixe zur Quantifizierung von bis zu fünf Targets mit stark unterschiedlicher Abundanz in einer QIAcuity Nanoplate. dPCR-Multiplexing spart Ihnen Zeit, Kosten und Probenmaterial, ohne die Datenqualität oder -gültigkeit zu beeinträchtigen.
  • dPCR-Kits für kontaminationsfreie Analysen – Es sind spezialisierte Kits für Applikationen verfügbar, die ultrareine Master-Mixe erfordern, welche kontaminierende Hintergrund-DNA minimieren. Das QIAcuity UCP Probe PCR Kit eignet sich ideal für die Analyse von Mikroorganismen oder für Qualitätskontrollapplikationen wie das Testen auf Rest-DNA. Die Kits bieten eine hohe Spezifität und Genauigkeit bei der Quantifizierung von gDNA oder cDNA in Singleplex- oder 5-plex-dPCR-Assays. 
  • Applikationsspezifische dPCR-Multiplex-Assays – Um für spezifische Applikationen den Durchsatz zu steigern und die Kosten zu senken, wurden dPCR-Assays mit verschiedenen Farbstoffen (FAM, HEX, ROX, Atto 500 und Cy5) entwickelt. Diese Multiplex-dPCR-Assays ermöglichen ein flexibles Experimentdesign und die Multiplex-Analyse von bis zu fünf Targets in einer Reaktion. Es sind spezifische dPCR-Assays für CNV-Analysen, den Nachweis von Mikroorganismen, Zell- und Gentherapie sowie LNA-Mutationsassays für krebsassoziierte Mutationen verfügbar.

Vorgestellte Produkte für die digitale Multiplex-PCR

Publikationen mit dPCR-Multiplexing

Die wissenschaftliche Community hat sich die Vorzüge der dPCR-Multiplex-Assays vollständig zu eigen gemacht. Werfen Sie einen Blick auf eine ausgewählte Liste publizierter Forschender, die die digitale PCR mit Multiplexing-Herangehensweise nutzen:
Applikation  Einsatz der Multiplex-dPCR  Literatur 

Investigation of the antimicrobial
potential of hydroquinine and
changes in gene expression that
may contribute to bacterial
resistance in P. aeruginosa.

Multiplex-Reverse-Transkription-PCR
(mRT-dPCR) zur Überprüfung des Vorliegens
mehrerer mit Effluxpumpen assoziierter
Gene

Rattanachak N, Weawsiangsang S, Jongjitvimol T,
Baldock RA, Jongjitwimol J. Hydroquinine possesses
antibacterial activity, and at half the MIC, induces
the overexpression of RND-type efflux pumps using
multiplex digital PCR in Pseudomonas aeruginosa.
Tropical Medicine and Infectious Diseases. 2022;
7(8):156.
Identifizierung und Dekonvolution
von Gemischen von Spezies,
die üblicherweise in Haushalten vorkommen, für forensische
Zwecke 		 Identifizierten Homo sapiens, Hund, Katze,
Rind, Schwein, Fisch und Huhn in zwei
Multiplexen 		 Ghemrawi M and McCord B. Development
of a nanoplate-based digital PCR assay for species
identification with mixture deconvolution. Forensic
Science International: Genetics Supplement Series.
2022; 8:193–195. 
Nachweis von besorgniserregenden
SARS-CoV-2-Varianten in belgischem
zufließendem Abwasser 		 Gezielter Multiplex-dPCR-Assay für den Nachweis
von vier verschiedenen besorgniserregenden Varianten (Variants of Concern, VOC)
und die Quantifizierung der RNA aus verschiedenen
SARS-CoV-2-VOCs in zufließendem Abwasser
 Booagaerts T et al. Optimization and application
of a multiplex digital PCR assay for the detection
of SARS-COV-2 variants of concern in Belgian
influent wastewater. Viruses. 2022; 14(3):610. 
Nachweis von Genfusionen
anhand von RNA 		 Multiplexierten Primer in der anfänglichen RT-PCR-Reaktion
unter Einsatz der ASPYRE-Technologie zur Identifizierung von
37 potenziellen Targets innerhalb von 3’-Genfusionsfamilien

 Gray ER at al. Ultra-sensitive molecular detection
of gene fusions from RNA using ASPYRE. 
BMC Medical Genomics. 2022; 15:215.

Mehr Ressourcen zur Multiplex-dPCR

Weitere Literaturhinweise
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