Verogen ForenSeq MainstAY Kit

• Größte Kombination etablierter STR in einer Amplifikation
• Erfüllt die europäischen/SWGDAM-Mindestanforderungen für Y-Haplotypen, CODIS, Interpol und ESS
• Vollständige Profile aus einer geringen Eingangsmenge an gDNA
• Erkennung von Allelen aus anspruchsvollen Proben mit hervorragender Ausgewogenheit und hohen Call-Raten
• Gleichzeitige Sequenzierung von 96 Proben je Lauf
• Zugelassen zum Hochladen in das Nationale DNA-Index-System (NDIS) für die Fallarbeit (nicht SE)

Zielen Sie mit der ForenSeq MainstAY-Produktlinie auf die wichtigsten autosomalen und Y-STR ab. Dies ist der einfachste Weg, um äußerst trennscharfe Daten für die reguläre Fallarbeit und Bestätigungstests in der forensischen Genealogie zu generieren. Wählen Sie zwischen zwei geografisch relevanten Optionen wie dem NDIS-geprüften ForenSeq MainstAY Kit, das speziell für die Unterstützung der meisten nationalen STR-Uploads in Datenbanken entwickelt wurde, oder dem ForenSeq MainstAY SE Kit, das den hochpolymorphen SE33-Marker enthält. Durch die Konzentration auf etablierte STR, die in Routineanwendungen zur Personenfeststellung verwendet werden und die Kompatibilität mit globalen Datenbanken gewährleisten, erleichtern die MainstAY-Produkte den Übergang zum Next Generation Sequencing. Der vertraute und bewährte ForenSeq-Arbeitsablauf erstellt umfassendere DNA-Profile für bis zu 96 Beweisproben in unter 2 Stunden praktischer Arbeit.

ForenSeq MainstAY bietet einen einfachen Übergangspunkt zur Aufnahme des Next Generation Sequencing (NGS) in Ihren Arbeitsablauf. NGS ermöglicht die gleichzeitige Typisierung unterschiedlicher STR-Kategorien in einer einzigen Reaktion, wodurch sich aus einer forensischen Probe ein Höchstmaß an Informationen gewinnen lässt. NGS vereint außerdem die Trennschärfe von STR mit zusätzlicher Variation auf Sequenzebene, wodurch Isoallele innerhalb einer STR aufgelöst werden können. Das ForenSeq MainstAY Kit enthält Reagenzien zur Amplifikation von 27 autosomalen und 25 Y-STR-Loci als kleine Amplifikate und zur Generierung von Sequenzierungsdaten auf dem MiSeq FGx Sequencing System unter Einsatz des MiSeq FGx Reagent Micro Kit. Mit diesem Arbeitsablauf können sowohl Sequenz- als auch Allellängen-Polymorphismen in den Au-STR und Y-STR in einer einzigen Amplifikation identifiziert werden. Dadurch müssen nicht mehr mehrere Arbeitsabläufe durchgeführt werden, und die Aussagekraft einer forensischen Probe wird maximiert, was die statistische Aussagekraft erhöht. NGS löst auch das Problem der sich überschneidenden Allele, so dass die Anwender mehr Allele im Multiplex abfragen können.

• Die Kombination von STR-Loci und Amelogenin ist ein wirksames Instrument bei der Personenidentifizierung
• Wahrt die Kompatibilität mit bestehenden Datenbanken weltweit
• Die Empfehlung niedriger Eingangsmengen von 1 ng gDNA liefert eine reproduzierbar hohe Call-Rate
• Analysieren Sie Sequenzdaten in einer vertrauten und benutzerfreundlichen Oberfläche mit dem MainstAY-Analysemodul
• Erstellung von Berichten in weniger als 1,5 Tagen

Die Einbeziehung von 27 Au-STR, 25 Y-STR und Amelogenin in einer einzigen Reaktion bietet eine höhere Likelihood-Ratio als die meisten handelsüblichen autosomalen STR-Kits und ermöglicht den Direktvergleich von Single-Source-Profilen (z. B. bei Datenbankrecherchen und internationalem Datenaustausch), unabhängig davon, welcher Assay zur Typisierung der Vergleichsprobe genutzt wurde. Das von ForenSeq MainstAY erstellte genetische Profil ermöglicht sowohl die Suche nach Fällen mit Au-STR als auch die Suche nach Haplotypen mit einer Y-STR-Datenbank. Die Y-STR erzeugen ein Haplotyp-Profil aus männlicher DNA, was sie bei der Arbeit mit männlichen/weiblichen Mischungen äußerst wertvoll macht. Gibt es nur einen männlichen Beteiligten, kann er dazu verwendet werden, potenzielle männliche Beteiligte auszuschließen.

Die maximale Anzahl der gleichzeitig zu sequenzierenden Bibliotheken hängt von der Anzahl der Reads bzw. der gewünschten Abdeckungstiefe (DoC) je Locus ab. Eine ausgewogene Leseabdeckung über alle Amplifikate hinweg ist ebenfalls entscheidend für die Rückgewinnung von Loci und Allelen. Das ForenSeq MainstAY Kit hat eine geringe Anzahl von Markern, die in einer einzigen Sequenzierungsreaktion gemultiplext werden, was zu einer hohen Gesamtabdeckung führt. Die Interlocus-Balance wurde mit MainstAY-Bibliotheken aus 1 ng Eingangs-DNA von 46 männlichen Coriell-Proben, einschließlich einer positiven Amplifikationskontrolle, 49 weiblichen Coriell-Proben und einem NTC bestimmt. Die mittlere Abdeckung der Au-STR und Y-STR für männliche Proben betrug 669 bzw. 469 Reads. Die mittlere Abdeckung der Au-STR für weibliche Proben betrug 1065 Reads. Der zigfache Unterschied zwischen den Au-STRs mit der höchsten und der niedrigsten Abdeckung betrug das 15-Fache, während der Unterschied zwischen den Y-STR mit den höchsten und niedrigsten Reads das 4,6-Fache betrug (siehe “Abbildung Mittlere DoC für die im ForenSeq MainstAY-Kit enthaltenen Marker”). Die mediane Interlocus-Balance für männliche Proben, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten Reads, betrug 1,9 % (Au-STRs: 2,2 % und Y-STR: 1,6 %). Bei weiblichen Proben betrug die Interlocus-Balance für die Au-STR 3,7 % (siehe Abbildung “Interlocus-Balance für die im ForenSeq MainstAY Kit enthaltenen genetischen Marker”).

Die Intralocus-Balance (ILB) oder Heterozygoten-Balance (HB) wurde als Verhältnis zwischen der geringeren Anzahl von Allel-Reads und der höheren Anzahl von Allel-Reads für ein Heterozygotenpaar berechnet. Im Gegensatz zu CE-basierten STR zeigt NGS eine größere Bandbreite für die ILB aufgrund von Amplifikationsverzerrungen für kleinere Amplifikate während der Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung. Die ILB für Heterozygoten und isometrische Genotypenpaare wurde in dieser Studie für jede Probe und jeden Locus anhand der 1-ng-DNA-Proben bewertet. Alle Marker des Panels wiesen ILB-Werte von über 60 % auf, der Medianwert lag bei 86 %. Die Abdeckung und die geringe Streuung des ForenSeq MainstAY Kit deuten darauf hin, dass die Amplifikate gut ausgewogen sind, was die Wahrscheinlichkeit von Locus- oder Allel-Dropouts verringert und die Identifizierung von geringfügigen Faktoren in einer Mischung verbessert (siehe Abbildung ”Intralocus-Balance für genetische Marker, die im ForenSeq MainstAY Kit mit 1-ng-DNA-Input enthalten sind”).

Die Fähigkeit, Genotypen und Haplotypen über eine Bandbreite von Eingangsmengen zu generieren, wurde mittels seriell verdünnter gDNA in Template-Mengen von 1 ng, 500 pg, 250 pg, 125 pg, 62,5 pg, 31,25 pg, 15,625 pg und 7,82 pg in Triplikaten bewertet. 96 Bibliotheken wurden gleichzeitig mit dem MiSeq FGx Reagent Micro Kit sequenziert. Bei der gleichzeitigen Sequenzierung von 96 Bibliotheken bietet das ForenSeq MainstAY Kit ein hohes Maß an Sensitivität, indem es vollständige Profile (kein Allelverlust) und eine Call-Rate von 100 % mit nur 62,5 pg DNA-Eingangsmenge liefert. Zur Bestimmung der Allel-Call-Rate und der vergleichenden Genauigkeit der sequenzierungsbasierten Genotypdaten wurden die Genotypen und Haplotypen mit dem MainstAY-Analysemodul in der Universal Analysis Software unter Verwendung der Standardeinstellungen generiert und mit orthogonalen Genotypisierungsdaten aus herkömmlichen Genotypisierungsverfahren (CE-Fragmentlängenerkennung für STR) verglichen. Au-STRs zeigten eine 100%ige Übereinstimmung bis zu 62,5 pg, mit einer Übereinstimmung von 95 % sogar bei 31 pg. Die Y-STR zeigten eine 100%ige Übereinstimmung bis zu 125 pg und eine 91%ige Übereinstimmung bis zu 31 pg. Alle nicht übereinstimmenden Calls waren das Ergebnis von Stottern, das den standardmäßigen Stotterfilter für 1-ng-Proben überstieg. (siehe Abbildung “Sensitivitätsstudie mit seriell verdünnten gDNA-Proben, die in dreifacher Ausführung amplifiziert wurden”).

Um die Konkordanz der mit dem ForenSeq MainstAY Kit generierten Genotypen und Haplotypen zu bewerten, wurden 31 Bibliotheken mit den NIST SRM 2391d-Standards, Coriell-DNA, einer positiven Amplifikationskontrolle und drei NTC erstellt und in dreifacher Ausführung sequenziert. Die Daten wurden mit dem MainstAY-Analysemodul in der Universal Analysis Software mit Standard-Analyseschwellenwerten und Stotterfiltern analysiert. Die Genauigkeit der Genotypen und Haplotyp-Allele wurde durch Vergleich mit orthogonalen CE-Daten bestimmt. Präzision und Call-Raten wurden anhand von Wiederholbarkeits- und Reproduzierbarkeitsexperimenten bestimmt, bei denen Bibliotheken aus 15 Kontroll-DNA-Proben in vierfacher Ausführung mit einer positiven Amplifikationskontrolle und drei NTC von drei Anwendern auf drei unterschiedlichen MiSeq FGx-Geräten vorbereitet und sequenziert wurden. Für Au-STR und Y-STR wurde eine hohe Genauigkeit (99,82 % bzw. 100 %) festgestellt. Unter den 3261 Au-STR-Allelen wurden sechs diskordante Allele entdeckt. Unter den 774 Y-STRs-Allelen wurden keine diskordanten Allele festgestellt. Ähnlich hohe Präzisionsraten von 99,87 % und 99,42 % wurden für Au-STR bzw. Y-STR beobachtet. Sämtliche Abweichungen wurden auf Stotterallele zurückgeführt, die die Standard-Stotterfilter überschreiten.

Um die Fähigkeit des ForenSeq MainstAY Kits zur Erkennung von Minor-Allelen in geringfügigen Faktoren zu bewerten, wurden Mischungen aus weiblichen und männlichen Kontrollproben mit 1 ng erzeugt, wobei die weibliche Probe den Hauptfaktor darstellte. Der prozentuale Anteil des Nebenfaktors in der Mischung lag zwischen 50 % und 0,2 %. Die Anzahl der eindeutigen, ungeteilten Nebenfaktor-Allele in der Mischung wurde unter Verwendung der standardmäßigen Analyse- und Interpretationsschwellenwerte sowie der Stutter-Filter im MainstAY-Analysemodul in der Universal Analysis Software bewertet (siehe Abbildung “Mischungen von weiblichen:männlichen gDNA-Kontrollproben mit seriell verdünnten Konzentrationen des Minorfaktors”). Bei einem Anteil des Nebenfaktors von 50 % fanden sich 31 eindeutige autosomale Nebenallele und 27 Y-Allele. Ungefähr 15 eindeutige autosomale Allele des Nebenfaktors (50 % eindeutige Au-STR-Allele) und 26 Y-Allele waren bei einer Konzentration des Nebenfaktors von 5 % nachweisbar. Bei einer Konzentration des Nebenfaktors von 1 % waren über 10 Y-STR-Loci nachweisbar. ForenSeq MainstAY ermöglicht die effiziente Identifizierung von Nebenfaktoren in einem Gemisch, selbst bei geringen Anteilen.

Die Fähigkeit zur Typisierung von Genotypen und Haplotypen degradierter DNA-Proben mit dem ForenSeq MainstAY-Arbeitsablauf wurde mit teilweise degradierter gDNA bewertet, die forensische Proben nachahmt, welche Umwelt- und chemischen Belastungen ausgesetzt waren. Bibliotheken aus 1 ng degradiertem Blut von 30 Proben, 1 positiver Amplifikationskontrolle und NTC wurden in dreifacher Ausführung angelegt und mit dem Miseq FGx Reagent Micro Kit sequenziert. Zur Bewertung der Probenqualität der Bibliotheken wurde der Degradationsindex (DI) verwendet. Proben mit einem DI-Wert von 1–4 galten als nicht degradiert, Proben mit einem DI-Wert von 4–10 als mäßig degradiert und solche mit einem DI-Wert > 10 als stark degradiert. Die mit MainstAY untersuchten und gering, mäßig und stark degradierten Proben wiesen einen DI-Wert zwischen 1 und 56 auf. Alle STR wurden in Proben ohne Degradation genau typisiert. Proben mit mäßiger Degradation wiesen eine Call-Rate von >85% korrekt typisierter STRs auf, während stark degradierte Proben eine Call-Rate von > 71 % aufwiesen, was auf einen minimalen Verlust an amplifizierbaren STRs hinweist. Bei der Probe mit dem höchsten DI von 56 wurden 60 % der Allele zurückgewonnen (40 von 74). ForenSeq MainstAY gestattet den Nachweis einer hohen Anzahl von Allelen selbst aus stark degradierten Proben (siehe Abbildung “Aus degradierten Blutproben extrahierte genomische DNA”).

Der ForenSeq MainstAY-Arbeitsablauf basiert auf der bekannten ForenSeq-Chemie, die dem Portfolio der Verogen Bibliotheksvorbereitung zugrunde liegt. Dieser empfindliche, PCR-basierte Assay amplifiziert effizient 53 Marker mit integrierten Unique Dual Indices (UDIs) und erzeugt kurze Amplifikate, die die Wahrscheinlichkeit des Allelnachweises aus degradierter DNA erhöhen. Ein DNA-Extrakt-Eingangsvolumen von 8 μl ermöglicht Flexibilität bei Proben mit geringer Konzentration und bei der Verdünnung inhibierter Proben.

Diese Komplettlösung enthält eine positive Amplifikationskontrolle, die den Kauf und die Kalibrierung erleichtert. Mit dem Kit lassen sich bis zu 96 Proben auf dem MiSeq FGx Reagent Micro Kit sequenzieren und analysieren, wobei die Long-Paired-End-Read-Fähigkeit des MiSeq FGx Sequencing System genutzt wird, was den Probendurchsatz maximiert und die Kosten je Probe minimiert. Die empfohlene geringe DNA-Eingangsmenge von 1 ng ermöglicht die zuverlässige und reproduzierbare Erstellung vollständiger Profile aus qualitativ hochwertigen Einzelquellproben bis hin zu geringen Eingangsmengen von 62,5 pg und schwierigen Proben.

Bei Einsatz des ForenSeq MainstAY Kit in Verbindung mit dem MiSeq FGx Sequencing System, dem MiSeq FGx Reagent Micro Kit und dem MainstAY-Analysemodul in der Universal Analysis Software (UAS) ist ein kompletter Arbeitsablauf in weniger als 30 Stunden möglich. Das MainstAY Analysis Module erlaubt die gezielte Exploration, eine umfassende Visualisierung mit Projekt- und Probenansichten sowie eine sorgfältige Überprüfung von STR-Allel-Calls mit umfangreichen Filter- und Sortierfunktionen. Außerdem werden von Menschen lesbare Berichte erstellt, die in mehrere Formate exportiert werden können. Dieser integrierte Arbeitsprozess bietet Laboren, die NGS für forensische Anwendungen in Betracht ziehen, den kostengünstigen Einstieg.

Der Arbeitsablauf umfasst fünf sichere Haltepunkte und eine vorgemischte Adapterplatte, die die Effizienz und Einfachheit der Bibliotheksvorbereitung erhöht. Der Arbeitsablauf ist mit einer Vielzahl gängiger forensischer DNA-Quellen kompatibel, z. B. mit extrahierter gDNA, Rohlysaten und Kartenstanzen von Speichermedien, beispielsweise FTA.

• Gezielte und effiziente Analyse für Massenverfahren in der Fallarbeit

Gleichzeitige Abfrage der größten Sammlung gut charakterisierter Loci, einschließlich 27 autosomaler STR und 25 Y-STR-Marker für bis zu 96 Proben. Erstellung ausgewogener Profile, die mit allen bestehenden STR-Datenbanken kompatibel sind, aus nur 100 pg. Effiziente Datenanalyse mit einem Analysemodul für minimale Interaktion und Auswahl aus einer Reihe von hochladefähigen Exportoptionen, die mit regionalen Datenbankanforderungen kompatibel sind.

• Bessere Daten, vergleichbare Kosten

Erstellen Sie Daten hoher Trennschärfe für die wichtigsten CODIS- und European Standard Set (ESS)-STR-Loci in einem einzigen Amplifikations- und Sequenzierungslauf zu vergleichbaren Kosten wie bei der herkömmlichen CE-Analyse. Nutzen Sie die Möglichkeiten des Next Generation Sequencing unabhängig von Ihren Durchsatzanforderungen mit zwei unterschiedlichen Größen von Sequenzierkits.

• Vollständige Integration und Unterstützung

Der komplette Arbeitsablauf basiert auf dem etablierten ForenSeq-Verfahren und ermöglicht eine Vielzahl von DNA-Analysen auf einer einzigen, bewährten Plattform. Das ForenSeq MainstAY Kit lässt sich nahtlos mit UAS verbinden, was die rasche Datenauswertung und Berichterstellung mit nur einem Mausklick ermöglicht.

Das MainstAY-Analysemodul in der Universal Analysis Software (UAS) ermöglicht die Auswertung von Sequenzierungsdaten anhand bekannter Qualitätsscores, Schwellenwerte und Leitlinien. In der Lösung sind vorkonfigurierte Analyseeinstellungen enthalten, die vom Labor wie gewünscht angepasst werden können. Darüber hinaus wurde dieses Modul entwickelt, um die betriebliche Effizienz forensischer Labore mit hohem Probenaufkommen zu steigern – durch optimierte Projekt- und Probenübersichten, die die Überprüfung von Markern mit Qualitätskontrollindikatoren erleichtern. Neue Sortier- und Filterfunktionen ermöglichen es den Anwendern, eine STR-Teilmenge anhand einer Vielzahl von Qualitätskontrollindikatoren zu kategorisieren und zu bewerten. Die Möglichkeit der einfachen Navigation zwischen Allel-Calls und Informationen auf Sequenzebene vereinfacht die Sequenzanalyse von STR-Allelen aus Populationen mit Mischallelen, beispielsweise isometrischen Heterozygoten.

Wir bieten hervorragende Unterstützung für den gesamten Arbeitsablauf, von der Bibliotheksvorbereitung über die Sequenzierung bis zur Analyse. Unser erfahrenes Team übernimmt umfassende Serviceleistungen für Ihre Geräte und Software, Validierungspläne und Implementierungsanleitungen, damit Sie Ihre Arbeitsabläufe schnell und problemlos in die Praxis umsetzen können.