His-Strep pQE-TriSystem Vector Set

• Parallelexpression in drei Systemen mit einem einzigen Konstrukt
• Erspart die zeitaufwändige Subklonierung
• Hohe Expressionslevel
• Streng regulierte Expression
• Verbesserte Stabilität zytotoxischer Konstrukte

Das His-Strep pQE-TriSystem Vector Set ermöglicht die Expression von Proteinen, die sowohl mit einem 6xHis-tag als auch mit dem Strep-tag II markiert sind. Die Doppelmarkierung ermöglicht die Aufreinigung durch ein zweistufiges Affinitätsaufreinigungssystem, das eine einfache und hocheffiziente Aufreinigung hochreiner Proteine in einem standardisierten Verfahren ermöglicht und den Durchsatz erhöht, da die Entwicklung und Optimierung proteinspezifischer Protokolle entfällt. Rekombinante Proteine, die beide Tags tragen, werden nacheinander auf Ni-NTA- und Strep-Tactin-Matrizes aufgereinigt (siehe Abbildung „ Zweistufiges Affinitätsverfahren“). Die beiden einfachen Affinitätsaufreinigungen liefern ein voll aktives und hochreines Volllängenprotein, das für jede nachgeschaltete Anwendung geeignet ist.

Rekombinante Proteine, die mit zwei kleinen Affinitäts-Tags (6xHis-tag und Strep-tag II) markiert sind, lassen sich mithilfe von pQE-TriSystem His-Strep-Vektoren effizient in E. coli-, Insekten- oder Säugerzellen exprimieren. Nach der Zelllyse und der Klärung des Lysats werden die Proteine zunächst mit einem Verfahren der immobilisierten Metall-Affinitätschromatographie (IMAC) gereinigt, die auf der bewährten 6xHis-tag:Ni-NTA-Interaktion basiert. Nach der Elution von der Ni-NTA-Matrix mit Imidazol werden die rekombinanten Proteine (die auch das Epitop Strep-tag II tragen) direkt auf eine Strep-Tactin-Matrix geladen (siehe Abbildung „Zweistufiges Affinitätsaufreinigungsverfahren“). Ein Pufferaustausch ist nicht erforderlich. Die Elution des Proteins von der Strep-Tactin-Matrix erfolgt entweder mit Biotin oder mit Desthiobiotin. Mit monoklonalen Strep-tag- oder Anti·His-Mausantikörpern können die Proteine mit hoher Spezifität und Sensitivität nachgewiesen werden (siehe Abbildung „ Hochsensitiver Nachweis von Proteinen mit einem Strep-tag“).

Das zweistufige Affinitätsaufreinigungssystem eignet sich optimal für Anwendungen, bei denen eine hohe Reinheit besonders wichtig oder mit His-tag allein nur schwer zu erreichen ist, z. B. für Proteine, die in eukaryotischen Zellen exprimiert werden. Die durch das zweistufige Affinitätsaufreinigungssystem ermöglichte ultrahohe Reinheit und die einfache Handhabung machen es zur Methode der Wahl für:

• Aufreinigung von hochreinen Proteinen
• Struktur- und Funktionsanalysen
• Expression in eukaryotischen Systemen