Anwendungen der digitalen PCR

Nachweis seltener Mutationen

Der Nachweis seltener Mutationen bezieht sich auf den Nachweis einer Sequenzvariante, die in einem Pool aus Wildtyp-Hintergrund in nur sehr geringer Menge vorliegt (weniger als 1 % oder sogar 0,1 %). Daher ist zum Nachweis und zur Quantifizierung von seltenen Ereignissen wie Punktmutationen oder Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) eine sensitive, genaue und präzise Methode erforderlich. Die Herausforderung besteht in der Unterscheidung zwischen zwei in hohem Maße identischen Sequenzen, von denen eine deutlich häufiger vorliegt als die andere.

Ein Beispiel für den Nachweis seltener Mutationen ist der Nachweis einer in geringer Menge vorliegenden Einzelnukleotid-Mutation in einer Krebsbiopsieprobe.

Analyse von Kopienzahlvariationen

Bei der Analyse von Kopienzahlvariationen (CNVs) wird die Anzahl an Kopien eines bestimmten Gens im Genom einer Person bestimmt. Es ist bekannt, dass Gene in zwei Kopien je Genom vorliegen; in einigen Fällen können diese Gene jedoch auch häufiger vorliegen. Genamplifikation (die Onkogene aktiviert) und -deletion (die Tumorsuppressorgene inaktiviert) sind wichtige Kopienzahlveränderungen (CNAs), die Auswirkungen auf krebsbezogene Gene haben, zusätzlich zu Genomveränderungen wie Punktmutationen, Translokationen und Inversionen. Die meisten von CNAs betroffenen Gene mit Krebsbezug wurden als kritische Gene in Krebs-Signalwegen definiert, die an Karzinogenese und Krebsprogression beteiligt sind. CNVs sind eine wesentliche Quelle der genetischen Diversität (Deletion oder Duplikation eines Locus) und erlauben die Untersuchung von Genen, die mit häufigen neurologischen und Autoimmunerkrankungen, Erbkrankheiten und unerwünschten Arzneimittelnebenwirkungen verbunden sind.

Genexpressionsanalyse

Beim Genexpressions-Profiling werden gleichzeitig die Expressionsniveaus mehrerer Gene für zwei oder mehr Proben verglichen. Diese Analyse kann Wissenschaftlern helfen, die molekulare Grundlage phänotypischer Unterschiede zu ermitteln und Zielgene für tiefergehende Studien auszuwählen. Genexpressions-Profiling liefert wertvolle Erkenntnisse über die Rolle der differenziellen Genexpression in normalen biologischen Zuständen und bei Erkrankungen.

miRNA-Expressionsanalyse

MicroRNA(miRNA)-Expressionsprofiling vergleicht gleichzeitig die Expressionsniveaus mehrerer oder einzelner miRNAs zwischen zwei oder mehr Proben. Diese Analyse kann Wissenschaftlern helfen, miRNA als Biomarker bei akuten Erkrankungen wie Krebs zu identifizieren und zu quantifizieren. Sie liefert wertvolle Erkenntnisse über die Rolle der miRNA-Expression in normalen biologischen Zuständen und bei Krankheiten.

Nachweis mikrobieller Pathogene

Die Kombination aus Geschwindigkeit, hoher Sensitivität, Genauigkeit und absoluter Quantifizierung ist sowohl für den Pathogennachweis als auch die Mikrobiom-Analyse im Gesundheitswesen und der Epidemiologie essenziell. Sie ist unerlässlich bei der Untersuchung der Phylogenie für Identifizierung, Nachweis, Charakterisierung und Überwachung der Änderungen bei Pathogenen und Mikrobiomen. Der Anwendungsbereich ist breit gefächert und erstreckt sich von Pathogenen in Lebensmitteln über Medikamentenresistenz bis hin zur Mikroorganismenforschung, der Untersuchung von Antibiotikaresistenzgenen usw. Beim Pathogennachweis werden mikrobielle Pathogene häufig zusammen mit Viren detektiert, so etwa bei der Viren/Bakterien-Wirts-Beziehung.

Quantifizierung der Viruslast

Beim Testen der Viruslast wird die Menge eines spezifischen Virus in einer biologischen Probe gemessen. Die Ergebnisse werden als die Anzahl der Virus-RNA-Kopien je Milliliter Probe angegeben. Tests der Viruslast werden verwendet, um akute Virusinfektionen zu diagnostizieren, Behandlungsoptionen abzuwägen und das Ansprechen auf eine medizinische Behandlung zu überwachen.

Flüssigbiopsie

Eine Flüssigbiopsie, auch bekannt als flüssige Biopsie oder Flüssigphasen-Biopsie, ist die Probenahme und Analyse eines nicht festen biologischen Gewebes, zumeist Blut. Sie wird hauptsächlich als Diagnose- und Überwachungstool für Krankheiten wie Krebs eingesetzt. Die Flüssigbiopsie ist verglichen mit der Gewebebiopsie weniger invasiv für den Spender. Wenn Tumorzellen absterben, setzen sie ctDNA ins Blut frei. Krebsmutationen in der ctDNA spiegeln jene aus herkömmlichen Tumorbiopsien wider und können von uns als molekulare Biomarker zur Nachverfolgung der Krankheit genutzt werden. Die Herausforderung ist die geringe Konzentration an ctDNA aus den Tumorzellen im Blut. Der Goldstandard war bisher die Verwendung von NGS, Pyrosequenzierung oder Real-time qPCR, aber diese Methoden hatten den Nachteil einer eingeschränkten LOD. Bei der Pyrosequenzierung für Tumorgewebe liegt sie bei etwa 10 %, bei der NGS zwischen 1 und 5 % und bei qPCR der qPCR bei bis zu 1 %. Diese begrenzten Nachweisniveaus stellen ein Problem bei der Überwachung auf ein mögliches Rezidiv beim Spender dar.

GMO-Nachweis

Die Bezeichnung „genetisch modifizierter Organismus (GMO)“ wird häufig zur Bezugnahme auf genetisch veränderte Nutzpflanzen verwendet. Genetic Engineering stellt die nötigen Technologien bereit, um bestimmte erwünschte Eigenschaften wie Virus-/Insektenresistenz, höhere Ernteerträge, eine verbesserte Zusammensetzung usw. einzubringen. Der GMO-Nachweis kann qualitativ (Vorhandensein) oder quantitativ (Menge an GMO) erfolgen. Er kann entweder ereignisspezifisch sein, also das Vorliegen einer für den spezifischen GMO eindeutigen DNA-Sequenz nachweisen, oder konstruktspezifisch, also eine in den GMO eingebrachte fremde DNA-Sequenz nachweisen. GMO-Tests werden von vielen Landwirten/Exporteuren/Importeuren gefordert, um die regulatorischen Anforderungen zu erfüllen. Real-time PCR, die derzeitige Methode der Wahl, weist Einschränkungen beim Nachweis und der Quantifizierung schwach konzentrierter DNA-Targets auf, wie sie häufig in komplexen Lebens-/Futtermittelmatrizes vorliegen.

Nachweis von Genomediting (CRISPR-Cas9)

In Studien zum Genomediting werden Nukleasen wie Zinkfinger (ZFN), Transcription activator-like effector (TALEN) und Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) zum Editing des Genoms einer Zelle verwendet. Diese Nukleasen produzieren stellenspezifische DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs), welche dann durch die unpräzisen, fehleranfälligen Stoffwechselwege des Non-homologous end joining (NHEJ) (Spender-Template/präzise Punktmutation) oder der Homology-directed repair (HDR) (Deletion/Indels/Insertionen) repariert werden können, was eine gezielte Mutagenese zur Folge hat. Dies führt zur Entstehung einer gemischten Population aus Zellen mit heterogenen Indel-Fehlern und variierenden Häufigkeiten editierter Allele. Im Anschluss werden die Häufigkeiten des Genomeditings am gewünschten Locus gemessen. Klonale Zelllinien isolieren Einzelzellen, welche dann untersucht werden, um das Genomediting-Ereignis zu verifizieren.

Quantifizierung und Validierung der NGS-Bibliothek

Quantifizierung und Validierung der NGS-Bibliothek werden heute mit anderen Methoden durchgeführt. Spektrophotometrische und fluorometrische Systeme und qPCR sind nur begrenzt zur genauen Quantifizierung der generierten Bibliotheken in der Lage. Für einen kosteneffektiven und genauen Sequenzierungslauf ist eine genaue Kenntnis der Konzentration Ihrer Bibliotheken jedoch entscheidend. Die Real-time PCR war bisher der Goldstandard für die Validierung des Sequenzierungslaufs. Der Nachteil ist die mangelnde Präzision, wenn eine Validierung von Ergebnissen Ihrer NGS unter 1 % erforderlich ist.

Quantifizierung verbleibender Wirtszell-DNA

Verbleibende Wirtszell-DNA (Residual Host Cell DNA, HCD) wird während des Herstellungsprozesses von therapeutischen Proteinen und Impfstoffen verschleppt. Die akzeptablen Konzentrationen wurden von Regulierungsbehörden wie der US Food and Drug Administration und der Weltgesundheitsorganisation festgelegt. Kits zur digitalen Quantifizierung von Rest-DNA eignen sich ideal für die hochpräzise Quantifizierung von HCD in komplexen Bioprozessen. Zu den Zellen, die im Rahmen der Entwicklung von Gentherapien, zellbasierten Impfstoffen und vergleichbaren Biotherapeutika oder anderen freigegeben werden müssen, zählen etwa HEK293, CHO oder E. coli.

Publikationen

Durchstöbern Sie eine wachsende Liste an Artikeln mit Anwendungen unter Einsatz der QIAGEN Nanoplatten-dPCR-Technologie.

• Huggett JF et al. (2022) Monkeypox: another test for PCR. Euro Surveill., 27(32).
• Amman, F et al. (2022) Viral variant-resolved wastewater surveillance of SARS-CoV-2 at national scale. Nat Biotechnol.
• Tasnim T et al. (2022) A duplex PCR assay for authentication of Ocimum basilicum L. and Ocimum tenuiflorum L in Tulsi churna. Food Control. Volume 137, 108790.
• Alexandra S et al. (2022) Digital PCR can augment the interpretation of RT-qPCR Cq values for SARS-CoV-2 diagnostics. Methods. Volume 201, Pages 5-14.
• Nyaruaba R et al. (2022) Digital PCR applications in the SARS-CoV-2/COVID-19 era: a roadmap for future outbreaks. Clin Microbiol Rev. Sep 21;35(3):e0016821.
• Sun N et al. (2022) Coupling lipid labeling and click chemistry enables isolation of extracellular vesicles for noninvasive detection of oncogenic gene alterations. Adv. Sci., 9, 2105853.
• Piao XM et al. (2022) Expression of RPL9 predicts the recurrence of non-muscle invasive bladder cancer with BCG therapy. Urol Oncol. May;40(5):197.e1-197.e9.
• Zaytseva M et al. (2022) Methodological challenges of digital PCR detection of the histone H3 K27M somatic variant in cerebrospinal fluid. Pathol Oncol Res. Apr 12;28:1610024. 
• Christoph S et al. (2022) Effects of varying flux and transmembrane pressure conditions during ceramic ultrafiltration on the infectivity and retention of MS2 bacteriophages. Separation and Purification Technology. Volume 299, 121709.
• Lindsey AM et al. (2022) Digital polymerase chain reaction strategies for accurate and precise detection of vector copy number in chimeric antigen receptor T-cell products. Cytotherapy.
• Boogaerts T et al. (2021). An alternative approach for bioanalytical assay optimization for wastewater-based epidemiology of SARS-CoV-2. Science of The Total Environment, Volume 789, Article 148043.
• Luo Y et al. (2020). Massively parallel single-molecule telomere length measurement with digital real-time PCR. Sci Adv. 6(34):eabb7944.
• Lee EG et al. (2021). TOMM40 RNA Transcription in Alzheimer’s Disease Brain and Its Implication in Mitochondrial Dysfunction. Genes. 12, 871.
• Wirtz RM et al. (2021). FGFR testing from matched tissue and urine samples within the prospective real world clinico-pathological register trial BRIDGister. Journal of Clinical Oncology. 39:15_suppl, e16532-e16532.
• [Preprint version only] Yang JX et al. (2021). Digital PCR quantification of DNA, RNA and extracellular microRNA of mouse oocytes.
• Ferasin L et al. (2021). Infection with SARS-CoV-2 variant B.1.1.7 detected in a group of dogs and cats with suspected myocarditis. Vet Rec. 2021 Nov;189(9):e944.
• [Preprint version only] Wu X et al. (2021). A Warm-start Digital CRISPR-based Method for the Quantitative Detection of Nucleic Acids.
• [Preprint version only] Viveros ML et al. (2021). Wild Type and Variants of Sars-Cov-2 in Parisian Sewage: Dynamics in Raw Water and Fate in Wastewater Treatment Plants.
• Romanelli K et al. (2021) Clinical and molecular characterization of thyroid cancer when seen as a second malignant neoplasm. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism. Volume: 12
• Murphy LA et al. (2021) Detection of Vector Copy Number in Bicistronic CD19xCD22 CAR T Cell Products with Digital PCR. Blood. 138 (Supplement 1): 4001.
• [Preprint version only] Toffoli M et al. (2021) Comprehensive analysis of GBA using a novel algorithm for Illumina whole-genome sequence data or targeted Nanopore sequencing.
• Passera A et al. (2021) Bacterial Communities in the Embryo of Maize Landraces: Relation with Susceptibility to Fusarium Ear Rot. Microorganisms, 9(11), 2388.