转染实验方案和应用

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这里为您介绍成功转染的实验方案、应用和实用技巧。
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转染是指将DNA或者RNA输送至真核细胞中。这是一种研究和控制基因表达的方法。克隆基因可以转染至细胞以便进行生物化学鉴定、突变分析,研究基因表达对于细胞生长的影响,研究基因调控元件和表达特定的蛋白。RNA转染可以诱导蛋白的表达,也可以通过反义RNA或者RNA干扰(RNAi)步骤抑制蛋白的表达。

有两种不同类型的转染,分别是瞬时转染和稳定转染。这两种转染适用于不同的实验应用,并且需要不同的载体。

转染的类型

瞬时转染

当一个细胞被质粒瞬时转染时,DNA进入细胞核中,但是并没有整合到染色体上。这意味着细胞核中存在目标基因的很多个拷贝,从而导致蛋白的高水平表达。在基因转染之后的24–96小时内能够分析其转录。使用超螺旋的质粒DNA对于瞬时转染是最有效的。siRNA、miRNA和mRNA也可用于瞬时转染,并且它们转染到细胞质中是效率最高的,并不需要转染到细胞核中。

稳定转染

在稳定或者永久性转染中,转染的DNA或者整合到染色体DNA中或者作为附加体保留在宿主细胞中。将质粒DNA稳定的整合到基因组中是很少发生的。可以将携带有抗生素抗性基因的其它质粒共转染到细胞中,或者在携带目标基因的载体上同时包含有抗生素的抗性基因,以便能够把稳定转染的细胞挑选出来。如果siRNA和miRNA是筛选DNA载体转录成的短发卡结构,则能稳定转染。但是,RNA分子本质上不能用于稳定转染。

尽管相对于超螺旋的DNA分子而言,线性的DNA分子被细胞摄取的概率比较低,但是线性的DNA分子更容易整合到宿主的基因组中。成功整合了目标DNA或者保留了附加体质粒DNA的细胞能够用一些选择性的标志物区别出来。常用的选择性标志物包括那些编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH;neoR 基因)或者潮霉素B磷酸转移酶(HPH)的基因。其它的选择性标志物包括编码腺苷脱氨酶(ADA)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、或者黄嘌呤–鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT;gpt基因)的基因。

快速正向转染和反向转染

在快速正向转染中,平板培养和转染在同一天进行。DNA或siRNA在不包含血清的培养基中稀释。转染试剂加入到稀释过的核酸里面以便形成转染试剂–核酸的复合物。细胞首先经过接种,然后复合物直接加入到刚被接种的细胞中。而在传统的转染中,细胞平板培养24小时之后才能进行转染。在转染前一天,细胞在包含血清的培养基中接种,并在正常的生长条件下孵育。第二天,在不包含血清的培养基中稀释DNA或者siRNA。转染试剂直接加入到稀释后的DNA或者siRNA中,以形成转染试剂–核酸复合物。在复合物的形成过程中,改变细胞的培养基,然后才能将转染复合物加入到细胞中。

在标准的转染或者快速正向转染中,细胞首先加入到孔板的小孔中,然后加入转染复合物。在反向转染中,核酸加入到孔板的小孔中,然后加入转染试剂。待二者形成复合物之后再向小孔中加入细胞,因此称做反向转染。

成功转染的一般准则

成功的转染受到很多因素的影响。细胞系的健康程度和存活力,使用的核酸的质量,转染试剂,转染时间的长度以及血清的存在与否都会影响转染。

细胞

应在合适的培养基中培养细胞,提供血清和生长因子,保证细胞系的存活力。不要使用被污染(比如被酵母或者支原体污染)的细胞或者培养基。如果无法确定是否符合这一要求,应该使用冷冻的、未污染的原液重新对细胞接种。如果有哪些成分是不稳定的,一定要保证基质是新鲜的,因为缺失任何关键的成分都会损害细胞的生长。请保持孵育条件稳定在37°C,正确的CO2水平(通常为5–10%)和100%的相对湿度。

每一个细胞系都有最优的培养条件,具体请参照美国模式培养物集存库(ATCC)网站。

血清

由于血清会干扰很多商业化的转染试剂,部分转染方案为获得最优性能,要求提供无血清条件。您应核对自己的实验方案,以确定是否需要满足这方面要求。

汇合

原则上,细胞应该在汇合度为40–80%的情况下进行转染。细胞太少会因为缺乏细胞和细胞的相互接触导致生长情况较差。而细胞太多则会导致接触抑制,使得细胞对外界核酸摄取发生抵抗。细胞具有活性且相互分离,才能获得最好的结果。

传代

注意保持较低的传代数(<50)。除此之外,在一系列实验中所使用的细胞的传代数应该保持一致。操作过程务必保持谨慎,确保在转染之前,用于转染的细胞互相分离并且具有至少90%的存活力。与无限增殖细胞系类似,细胞的特征可能随着时间而改变,在传过数代之后,细胞可能对于相同的转染条件并无反应,造成较差的表达结果。

核酸的量

核酸的量的最佳值存在很大差异,具体取决于核酸的类型、细胞的数目、培养皿/平板的尺寸和选用的细胞系。

显著增大转染核酸量并不能得到更好的结果。事实上,如果初始的转染结果令人满意的,应减少核酸量并测试其效果(选取最佳试剂/核酸比常数)。

在部分情况下,某个范围内的核酸浓度对于转染是最合适的;而在此范围之外,转染效率会降低,甚至大幅降低。

核酸太少可能导致实验效果不出现。核酸太多则会对细胞产生毒害。

转染试剂的量

这取决于所使用的转染试剂,应该仔细的优化这一参数。

转染复合物的形成和复合物的孵育时间

很多化学转染试剂都有最佳的时间框,在这个时间范围内,能形成具有最佳半径的转染复合物。这个时间范围通常在5到30分钟,具体取决于转染试剂的性质。请参考试剂厂商推荐的时间。

通常情况下,在加入新的培养基或者替换培养基之前,转染试剂应该和细胞接触一段时间(以便最大程度的减小试剂的毒害作用)。最佳的转染时间取决于细胞系,转染试剂和所使用的核酸。

部分情况下,相对于将转染复合物加入到培育好的细胞上这种传统方法, 在含有转染复合物的孔或平板上培养细胞会增大转染效率。这种反向转染方案的另一个优点是可以在同一天完成细胞的接种和转染,将实验流程缩短一整天。

DNA转染准则

质粒DNA转染注意事项

DNA的质量能强烈影响转染的效果。使用最高纯度的质粒DNA,才能获得最佳的转染效果。

内毒素,也被称做脂多糖(LPS),是格兰氏阴性菌(比如大肠杆菌)细胞膜的成分。它通常在质粒制备的裂解步骤中释放出来,并且与质粒DNA共纯化。与质粒DNA共存的内毒素会导致转染效率显著下降,特别是对于原代细胞和敏感性的细胞系而言。如果要转染内毒素敏感的细胞(比如原代细胞、悬浮细胞和造血细胞),或者想要获得最高的转染效率和最低的细胞毒性,我们推荐使用一些商业化的试剂盒来纯化DNA——这些试剂盒是经过专门的设计,能去除内毒素,保证得到最佳的转染结果。

DNA分子的构象也会影响转染的效率。使用超螺旋的质粒DNA能够达到最高的瞬时转染的效率。在稳定转染中,相对于质粒DNA而言,线性DNA更容易整合到宿主基因组中,尽管线性DNA进入细胞比质粒DNA要难。

如果转染到细胞中的DNA编码产物对于细胞有毒害作用,则其表达会导致细胞死亡。在这种情况下,可以使用较弱的启动子或者可诱导的启动子限制毒性基因产物表达对细胞造成的损害。

转染技术选择

关于核酸的转染,目前发展了几种不同的方法,这些方法分别使用了DEAE–右旋糖苷、磷酸钙、电穿孔、脂质体、非脂质体的脂质和活化的树枝状分子。转染技术的选择能强烈的影响转染效率。理想情况下,转染应该迅速并且易于操作,有较高的转染效率和可重复性的结果,并且具有最低的细胞毒性。

优化的重要性

为了得到最佳结果和最高效率的转染,应该根据每一种细胞系–质粒的组合选择最佳的DNA/转染试剂比。因此,对于每一种新使用的细胞系–质粒组合而言,进行实验优化非常关键。

RNA转染准则

随着RNA干扰(一种使用siRNA、siRNA、诱导基因沉默的技术)的发现,RNA转染变得日益重要。

RNA转染注意事项

很多RNA(包括mRNA、体外转录的RNA、病毒RNA、RNA寡聚物、siRNA和核酶)都能够用于转染。对于mRNA,一些特征的存在与否(比如5’端帽子、内部核糖体进入位点或者poly–A尾),能显著的影响转染效率。

使用最高纯度、无DNA和蛋白污染的RNA转染时,能得到最佳的转染结果。同时还应考虑到,如果所表达的基因对细胞有毒性的话,过量表达可能导致细胞死亡。

有许多厂商能够提供高纯度即用型siRNA,供您进行RNA干扰实验。为获得最佳的基因沉默效果,必须使用正确的序列。应该注意到,关闭必需基因的表达可能会导致细胞死亡。

避免RNA污染

目前仍无任何纯化方法能保证RNA完全不受DNA污染,即使在琼脂糖凝胶上看不到DNA条带,也并不能保证这一点。在进行RNA转染时,可以使用不含RNase的的DNase纯化RNA,或者使用其它能取得类似效果的纯化方法。

核糖核酸酶(RNase)非常稳定,并且通常不需要辅因子就能发挥功能。由于RNase很难失活并且数分钟内就能够破坏RNA,塑料耗材、玻璃器皿或者溶液在使用之前必须排除任何RNase污染的可能性。在转染过程中,必须非常仔细,以避免不经意间引入任何RNase污染。为了在处理RNA时创造并且维持一个没有RNase的环境,应该采取一些微生物学上的无菌技术,并且推荐使用一些无菌的一次性的塑料试管。

优化的重要性

为了得到最佳RNA转染结果,须优化以下因素:

  • 转染时的细胞密度
  • RNA与转染试剂的比例
  • 与转染复合物共同孵育的时间

我们建议,对于每一种细胞类型和RNA的组合,都要仔细的优化这些参数。一旦得到了最优值,这些参数在未来的实验中应该保持不变。

siRNA转染准则

RNA干扰(RNAi)在哺乳动物细胞中的应用,给功能基因组学领域带来了革命性的变化。其所具有的简单、有效的下调哺乳动物细胞中特定基因表达的能力,在科学、商业和医疗领域有着潜在的巨大应用。siRNA高效转染是有效沉默基因的关键。

RNA干扰实验中的脱靶效应

研究表明,siRNA转染会导致脱靶效应,即siRNA影响了非同源性基因或者半同源性基因的表达。脱靶效应包括mRNA降解、翻译抑制或者诱导干扰素应答(5–8)。脱靶效应的机制目前还不完全清楚。可能是由于siRNA和与目标mRNA具有高度同源性的mRNA相互作用,或者是由于siRNA发挥了和miRNA相似的功能,还可能是由于细胞对于siRNA毒性的应激反应。除此之外,一些研究者还观察到了siRNA诱导的干扰素应答。

脱靶效应能导致RNA干扰实验中的错误结果。研究认为,使用低浓度的siRNA能够很大程度上避免脱靶效应。

siRNA转染的优化
计算siRNA浓度

一个双链,20 nt长度的siRNA分子的一些近似数值:

  • 20 µM浓度的siRNA大约相当于0.25 µg/µl
  • 21核苷酸长度的siRNA的分子量大约为13–15 µg/nmol

为确保最佳的贴壁细胞siRNA转染效果,建议优化以下参数。

siRNA的量

siRNA的量对于有效转染和基因沉默是非常关键的。对于所使用的每一种细胞类型和siRNA的组合,都应该优化转染试剂和siRNA的比例。

转染时的细胞密度

对于每一种要转染的细胞类型,应该确定其转染时的最佳的细胞汇合度,并且在以后的实验中保持恒定。这可以通过在接种前对细胞进行计数来实现。在使用传统方案的情况下,可以通过在接种常数和转染常数之间保持时间间隔来实现。这样可以确保细胞的密度不是太高,并保证细胞在转染时维持最佳的生理状况。

不同形式的细胞的接种数量的准则显示在下列表格中:贴壁细胞接种的典型数目、悬浮细胞和巨噬细胞接种的典型数目以及原代细胞接种的典型数目。

贴壁细胞接种的典型数目
培养容器规格 快速正向转染或反向转染(转染当天) 传统实验方案(转染前一天)
384孔板 4000–10,000 2000–5000
96孔板 1–5 x 104 0.5–3 x 104
48孔板 2–8 x 104 1–4 x 104
24孔板 0.4–1.6 x 105 2–8 x 104
12孔板 0.8–3 x 105 0.4–1.6 x 105
6孔板 1.5–6 x 105 0.8–3 x 105
60 mm培养皿 0.3–1.2 x 106 1.5–6 x 105
100 mm培养皿 2–4 x 106 1–2 x 106

 

悬浮细胞和巨噬细胞接种的典型数目
培养容器规格 建议接种的细胞数
96孔板 3–6 x 104 悬浮细胞
24孔板 1–2 x 105 悬浮细胞
96孔板 1–6 x 104 巨噬细胞
24孔板 0.4–2 x 105 巨噬细胞
96孔板 3–6 x 103 分化巨噬细胞
24孔板 1–2 x 104 分化巨噬细胞

 

原代细胞接种的典型数目
培养容器规格 建议接种的细胞数
96孔板 20,000
48孔板 40,000
24孔板 60,000
12孔板 120,000
6孔板 200,000
多孔板转染——制备预混液

如果你在多孔板上进行转染,则需要制备转染复合物预混液或者转染试剂和培养基质(取决于实验方案)的预混液以便注入孔板的小孔中。

  • 在制备预混液之前,计算所需的每一种成分的体积以及总体积。
  • 准备比需要的量多10%的预混液以避免移液错误(也就是说,对于一个48孔板,准备足够53个小孔使用的预混液)。
  • 用一个可重复使用的移液器来分配预混液。

进行合适的RNA干扰对照实验

进行合适的对照实验是非常重要的,只有这样,才能够正确地解释实验结果。我们推荐下列对照实验。

阳性对照siRNA

这种siRNA是指已经明确知道能高效率敲除目标基因的siRNA。阳性对照用来确定转染实验和敲除分析的实验设置能在最佳的状态下工作。如果一个siRNA所敲除的基因能影响正在研究的表型,那么这个siRNA也应该用做阳性对照,以确保对表型的评估能在最佳状态下工作。在每一个RNA干扰实验中,都应该转染阳性对照siRNA。

阴性对照siRNA

阴性对照siRNA应该是不具有基因沉默效果的siRNA,并与所有已知的哺乳动物基因都没有同源性。转染阴性对照siRNA是为了确定表型和基因表达的改变是否是非特异性的。在每一个RNA干扰实验中,都应该转染一个阴性对照siRNA。

转染对照siRNA

这种对照组是为了测定转染的效率。转染的效率可以通过几种不同的方式来测定,比如在转染荧光标记的siRNA之后使用荧光显微镜检测,或者在转染影响细胞存活的必需基因的siRNA之后,观测细胞的死亡水平。这种对照应该用于实验参数的优化,比如,当对一个新的细胞系进行RNA干扰实验时。

Mock转染对照

Mock转染对照中的细胞经历完整的转染过程,但是并不加入siRNA(也就是说,细胞仅用转染试剂处理)。这种对照实验是为了排除任何由转染试剂或者转染过程所引起的非特异性现象。

未转染细胞对照

应该对未经处理的细胞进行基因表达的分析,以便测定正常水平的基因表达。未经处理的细胞的分析结果可以与所有其它样本的结果相比较。在每一个RNA干扰实验中都应该对未经处理的细胞进行分析。

用于表型确认的额外的siRNA

敲除基因对表型的影响必须用至少一个额外的siRNA进行确认。这个额外的siRNA应该以mRNA的不同区域作为靶标。

miRNA转染操作指南

microRNA(miRNA)是一系列与siRNAs具有相似特征的内源性小RNA分子。近些年来,已经发现miRNA在许多不同的生物过程中发挥着作用,比如发育、分化和凋亡。miRNA表达的异常调节已被报道与数种癌症和其他疾病有关。

miRNA系统是基因表达的一种内源性调控机制。成熟的miRNA主要是通过转录后抑制起到内源性基因调控的作用。此外,miRNAs可以通过脱腺苷化和/或者脱帽介导mRNA的破坏。自然生成的miRNA–结合位点通常位于目标mRNAs的3'端非编码区(UTR)。它们的部分互补性使得真正结合位点的阳性鉴定变得困难和不精确。

转染miRNA模拟物或抑制剂是一种用于鉴别特定miRNA的靶标和作用的技术。miRNA模拟物是化学合成的miRNA,其模拟的是细胞转染后自然生成的miRNA。miRNA抑制剂是单链、经过修饰的RNA,其在转染后特异性的抑制miRNA功能。转染一个miRNA模拟物后导致的基因表达减少或者转染一个miRNA抑制剂后导致的表达增加都证明了所研究的miRNA参与了基因调控。另外,miRNA在各种路径中所起的作用可以在转染miRNA模拟物或者抑制剂后通过检查一个特定的表型来研究。

miRNA模拟物或者抑制剂转染

当使用24孔板时,我们建议首先在孔板中植入细胞,然后再加入模拟物/抑制剂–试剂复合物,目的是确保细胞与复合物混合最优。但是,反向转染是首先向孔板中加入复合物,然后再在复合物之上加入细胞,根据具体需要而操作。如需进行反向转染,简单的调换向孔板加入细胞与复合物的顺序。

但是,对于96孔板,我们建议使用反向转染,因为反向转染快速而且方便,并且通常被用于高通量模式。反向转染也是miRNA模拟物和miRNA抑制剂在24孔板上进行共转染的最优方法。

质粒DNA和miRNA模拟物/抑制剂共转染

很多miRNA实验涉及到miRNA模拟物和/或抑制剂与质粒DNA载体一起进行的共转染,在载体中miRNA–结合位点融合了一个报告基因,比如荧光素酶。

优化miRNA转染

有效下调目标基因或者抑制miRNA功能所需miRNA/抑制剂的量差异很大,具体取决于miRNA、细胞株系和所选的分析方法。为了测定提供最优结果所需的浓度,需要使用不同浓度的模拟物/抑制剂进行优化实验。

miRNA模拟物最终浓度低到0.5 nM即可抑制目标蛋白的表达。但是,也可能需要一个更高的浓度,尤其是在蛋白质水平上进行下游分析时。经证实,miRNA抑制剂在50 nM浓度即可抑制miRNA的功能。更低的抑制剂浓度也可能有效。

除了优化浓度,测定转染后分析结果的最优化时间的时程实验也是必须的。miRNA模拟物或抑制剂的效果通常并不会导致转录或者蛋白质水平立刻改变。

进行正确的miRNA对照实验

为正确解释miRNA模拟物或抑制剂实验结果,使用正确的对照非常重要。每个实验都应该包括适当的阳性和阴性对照。为了使结果解释或者问题解决成为可能,额外的对照也是必须的。

miRNA模拟物实验–阳性对照

阳性对照模拟物转染可用于确定实验系统正按照预期进行(比如,模拟物有效转染并且下调目标基因)。这个对照也可以用在浓度优化实验中,其通过不同浓度转染以测定提供最优结果的浓度。阳性对照通常应该在每个使用miRNA模拟物的实验中进行转染,以便确定实验条件始终是最优的。

miRNA模拟物实验–阴性对照

阴性对照应该在每个实验中转染,可以显示实验结果是否是非特异性的。阴性对照与所研究miRNA模拟物的实验结果的对比可以用于确定观察结果特异于所研究的miRNA。阴性对照的实验结果也应该与未被转染的细胞结果进行对比。在阴性对照实验中,未转染细胞与转染细胞的基因表达与表型应该相似。由于miRNA模拟物与siRNA化学上相似,通常只是在序列上有所不同,所以一个阴性对照siRNA也可以用作一个阴性对照miRNA模拟物。

miRNA模拟物实验–阳性对照

在涉及miRNA抑制剂转染的实验中,由于在细胞中存在与目标基因相互作用的其他miRNA,抑制剂效果测定通常会非常复杂。与模拟物单独转染相比,模拟物和抑制剂的共转染可能导致表达增加。这确定了抑制剂有效地抑制了模拟物,导致了目标基因的上调。

在报告载体用于下游分析的实验中,载体、模拟物和抑制剂都应该一起共转染,而在其平行实验中,载体和模拟物应该共转染与模拟物单独转染相比,模拟物和抑制剂的转染可能导致表达增加。这确定了抑制剂有效地抑制了模拟物,导致了报告基因上调。

miRNA抑制剂实验–阴性对照

在每个抑制剂实验中转染阴性对照,可以显示实验结果是否是非特异性的。该对照转染后得到的结果应该与未转染的细胞结果相似。阴性对照与所研究抑制剂的实验结果的对比可以用于确定观察结果特异于所研究的抑制剂。

在报告载体用于下游分析的实验中,阴性对照应该是抑制剂阴性对照与报告载体的共转染。

转染对照

为获得最优实验结果,转染效率应该尽可能的高。开始进行实验或者使用一种新的细胞株系时,需要在不同条件下操作多重转染以便确定获得最高转染效率的最优条件。在以后的实验中可以保存与阴性对照转染相比导致最大程度细胞死亡的转染条件。该对照的操作应该出现在优化实验和初始实验中,并且可以用作每个实验中的常规转染对照。

参考文献

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