什么是多重数字 PCR?
PCR 的多重检测能够在单个反应中检测多种靶标分子或序列。可通过改变使用的荧光基团种类来实现数字 PCR (dPCR) 的多重检测。在传统的多色多重检测中,每个靶标使用一种探针进行区分,探针与具有不同发射光谱的染料相结合。大多数 dPCR 仪器能够至少提供两个检测通道,进而对不同荧光基团进行检测。一些 dPCR 系统能够实现 5 色多重检测,从而在一个反应中清晰地区分更多的靶标。
dPCR 多重检测的优势
具有高重检测能力的数字 PCR 仪器,使您能够以更高的灵敏性和重复性对一个样本中的多个靶标进行分析。例如,QIAcuity Digital PCR System 具有多种配置,可满足您对样本和靶标分析的需求。
使用纳米微孔板数字 PCR 进行多重反应的优势
多重数字 PCR 是首选的方法,因为它比多重 qPCR 具有更高的灵活性、灵敏性和特异性。通过 qPCR 进行多重检测可能需要更复杂的方法来计算绝对值,并且该方法更易受到一个反应中进行多个 PCR 的干扰。
与其他数字 PCR 类型相比,纳米微孔板数字 PCR 具有明显的优势,包括运行时间短、精确度和灵敏度高以及多重检测能力。由于纳米微孔板 dPCR 依赖于独立反应单元PCR扩增,而不是对整体进行分析,因此有利于发现罕见的靶标(<10-20 个拷贝/反应)。
纳米微孔板数字 PCR 可以适应各种样本基质,从而能够在 AAV 生产的更多阶段进行准确滴定。QIAcuity Digital PCR System 使独立用户能够并行运行多项检测分析以提高工作效率(29)。
QIAcuity Digital PCR System 的高通量和多重检测特性
QIAcuity One | QIAcuity Four | QIAcuity Eight | |
---|---|---|---|
检测通道 (多重) |
2 或 5 | 5 | 5 |
单个工作日内分析样本数量 |
至多 384 |
至多 672 |
至多 1248 |
推荐的染料 |
FAM;VIC、HEX;TAMRA;ROX;Cy5 |
5 重 dPCR 数据是什么样的?
在左图中,使用 10 ng(A,上图和下图)和 1 ng(B,上图和下图)cDNA 作为模板上样量进行 dPCR 反应。使用 QIAcuity One, 5plex System 和 QIAcuity Nanoplate 8.5K 96-well 对五个靶标(ERBB2、EGFR、CDKN2A、KDR 和 CDK1)进行五重 dPCR 检测。分别使用 FAM、HEX、TAMRA、ROX 和 Cy5 对探针进行标记。 2D 散点图显示在多重检测中单个检测的清晰分离情况。
多重 dPCR 的应用
使用多重数字 PCR 进行准确定量的注意事项
- 优化单个检测方案:在 dPCR 多重检测之前验证单个反应(如二聚体)
- 评估引物和探针:检查引物和探针之间的潜在相互作用
- 精心挑选染料:精心挑选每个探针的染料;为低拷贝靶标选择具有明亮荧光基团的染料
- 检查连锁基因:调查基因连锁或高阶相关性;例如,使用基于连锁的 assay 来测量靶标的顺式与反式构型以及潜在的结构重排
- 避免交叉杂交:如有可能,可设计包含两个或多个核苷酸缺失或插入的探针-靶标变异,以避免探针不匹配
- 最大限度减少光学串扰:如果某种染料的荧光信号被多个通道所采集,则会发生光学串扰;如有可能,请尽量确保共轭染料与光学检测系统相匹配,或者在分析软件中调整信号处理参数
- 减少雨滴现象:雨滴现象描述了高于阴性反应分区但低于阳性反应分区的反应分区子集。您可以通过重新评估模板类型、确认、完整性、引物探针特异性以及反应中抑制物来减少雨滴现象;考虑设置不同的阈值,以避免雨滴现象对定量的影响
开始使用多重 dPCR
如果您对多重数字 PCR 感兴趣,请考虑投资具有高级多重检测功能的 dPCR 仪器。同时,大量用于多重数字 PCR 的 dPCR 试剂盒和 dPCR assay,可为初学者和专家带有益处。
- 您的数字 PCR 仪器 – 有多种类型的数字 PCR 系统可供选择,但部分系统提供更多重数检测选项。例如,QIAcuity dPCR 系统至多可实现 5 重检测(外加一个参比通道),可提供最简单的多重检测方法,并且节省时间和试剂:
通道 | 激发 (nm) | 发射 (nm) | 荧光基团示例 |
---|---|---|---|
绿色 |
463 – 503 |
518 – 548 |
FAM |
黄色 |
514 – 535 |
550 – 564 |
HEX、VIC |
橙色 |
543 – 565 |
580 – 606 |
TAMRA、ATTO 550 |
红色 |
570 – 596 |
611 – 653 |
ROX、Texas Red |
深红色 |
590 – 640 |
654 – 692 |
Cy5 |
- 多用途 dPCR 试剂盒 – 适用于多重 dPCR 反应。QIAcuity Probe PCR Kit 内含特殊的预混液,可在 QIAcuity Nanoplate 上同时定量丰度相差较大的五个靶标。dPCR 多重检测能够在不影响数据质量或有效性的情况下节省时间、成本和样本。
- 用于无污染分析的 dPCR 试剂盒 – 专用于需要超洁净预混液应用的试剂盒,可最大限度减少污染性背景 DNA。QIAcuity UCP Probe PCR Kit 是微生物分析或质量控制应用(如残留 DNA 检测)的理想选择。该试剂盒具有高度特异性和准确性,可在单重或 5 重 dPCR 中定量 gDNA 或 cDNA 。
- 特定应用的 dPCR 多重检测 assay – 为提高特定应用通量并降低成本,已开发出使用不同荧光染料(FAM、HEX、ROX、Atto 500 和 Cy5)的 dPCR assay。这些多重 dPCR assay 能够在一个反应中对多达五个靶标进行灵活的实验设计和多重分析。特定 dPCR 检测 assay 可用于 CNV 分析、微生物检测、细胞和基因治疗以及癌症相关的突变检测。
多重数字 PCR 的重点产品
dPCR 多重检测发表文献
应用 | 多重 dPCR 的用途 | 参考文献 |
---|---|---|
研究氢化奎宁的抗菌 |
多重逆转录数字 PCR ( |
Rattanachak N, Weawsiangsang S, Jongjitvimol T, |
出于法医目的对家庭中 常见的物种混合物 进行鉴定和解卷积 |
在两个多重反应中鉴定 人、犬、猫、牛、猪、 鱼和鸡 |
Ghemrawi M and McCord B. Development of a nanoplate-based digital PCR assay for species identification with mixture deconvolution. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 2022; 8:193–195. |
比利时废水中 SARS-CoV-2 变异株的检测 |
靶向多重 dPCR assay 检测四种 不同变异株 (VOC), 并定量废水中不同 SARS-CoV-2 VOC 的 RNA |
Booagaerts T et al.Optimization and application of a multiplex digital PCR assay for the detection of SARS-COV-2 variants of concern in Belgian influent wastewater. Viruses.2022; 14(3):610. |
RNA 融合 基因检测 |
使用基于 ASPYRE 技术的多重 RT-PCR 方案对 3’基因融合家族的 37 个潜在靶标进行检测 |
Gray ER at al.Ultra-sensitive molecular detection of gene fusions from RNA using ASPYRE. BMC Medical Genomics.2022; 15:215. |
关于多重 dPCR 的更多资源
更多参考文献
- Whale AS, Huggett JF, Tzonev S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR.Biomolecular Detection and Quantification.2016; 10:15–23.
- Izadpanah M et al.Simple and fast multiplex PCR method for detection of species origin in meat products.Journal of Food Science and Technology.2017; 55(2): 698–703.
- Lee YM, Lee S, Kim HY.A multiplex PCR assay combined with capillary electrophoresis for the simultaneous identification of Atlantic cod, Pacific cod, blue whiting, haddock, and Alaska pollock.Foods.2021; 10(11):2631.
- Pecoraro S et al.Overview and recommendations for the application of digital PCR.EUR 29673 EN, Publications Office of the European Union, Luxembourg, 2019.https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/doc/WG-dPCR-Report.pdf.
- Dobnik D, Spilsberg B, Bogožalec K, Holst-Jensen A and Žel J. Multiplex quantification of 12 European Union authorized genetically modified maize lines with droplet digital polymerase chain reaction.Analytical Chemistry.2015; 87(16):8218–8226.
- Lao TD, Le TAH.Exploring the multiplex PCR for detection of animal-derived ingredients in vegetarian foods.Pharmacopore.2020; 3.
- Boukharouba A, González A., García-Ferrús M., Ferrús A. Botella S. Simultaneous detection of four main foodborne pathogens in ready-to-eat-food by using a simple and rapid multiplex PCR (mPCR) assay.International Journal of Environmental Research and Public Health.2022; 19(3): 1031.
- Appay R et al.Multiplexed droplet digital PCR assays for the simultaneous screening of major genetic alterations in tumors of the central nervous system.Frontiers in Oncology.2020; 10:579762.
- Peitz C et al.Multiplexed quantification of four neuroblastoma DNA targets in a single droplet digital PCR reaction.Journal of Molecular Diagnostics.2020; 22(11):1309–1323.
- Jiang L et al.Development and validation of a 4-color multiplexing spinal muscular atrophy (SMA) genotyping assay on a novel integrated digital PCR instrument.Scientific Reports.2020; 10: 19892.
- Oscorbin I, Kechin A, Boyarskikh U., Filipenko M. Multiplex ddPCR assay for screening copy number variations in BRCA1 gene.Breast Cancer Research and Treatment.2019; 178(3):545–555.
- Hughesman CB et al.A robust protocol for using multiplexed droplet digital PCR to quantify somatic copy number alterations in clinical tissue specimens.PLOS ONE.2016; 11(8): e0161274
- Yu Q. et al.Multiplex picoliter-droplet digital PCR for quantitative assessment of EGFR mutations in circulating cell-free DNA derived from advanced non-small cell lung cancer patients.Molecular Medicine Reports.2017; 16(2):1157–1166.
- Andersen RF And Jakobsen A. Screening for circulating RAS/RAF mutations by multiplex digital PCR.Clinica Chimica Acta.2016; 458:138–143.
- Corné J et al.Development of multiplex digital PCR assays for the detection of PIK3CA mutations in the plasma of metastatic breast cancer patients.Scientific Reports.2021; 11(1):17316.
- Dong L et al.A rapid multiplex assay of human malaria parasites by digital PCR.Clinica Chimica Acta.2023; 539:70–78.
- Shi K et al.A multiplex crystal digital PCR for detection of African Swine Fever Virus, Classical Swine Fever Virus, and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus.Frontiers in Veterinary Science.2022; 9:926881.
- Wu, J et al. Clinical validation of a multiplex droplet digital PCR for diagnosing suspected bloodstream infections in ICU practice: a promising diagnostic tool. Crit Care.2022; 26: 243.
- Zhu X et al.Development of a multiplex droplet digital PCR assay for detection of enterovirus, parechovirus, herpes simplex virus 1 and 2 simultaneously for diagnosis of viral CNS infections. Virology Journal.2022; 19:70.
- Maggi R, Breitschwerdt EB, Qurollo B, Miller JC.Development of a multiplex droplet digital PCR assay for the detection of Babesia, Bartonella, and Borrelia species.Pathogens 2021; 10(11):1462.
- Shin J et al.Duplex dPCR system for rapid identification of gram-negative pathogens in the blood of patients with bloodstream infection: A culture-independent approach.Journal of Microbiology and Biotechnology.2021; 31(11):1481–1489.
- Te SH, Chen EY, Gin KYH.Comparison of Quantitative PCR and Droplet Digital PCR Multiplex Assays for Two Genera of Bloom-Forming Cyanobacteria Cylindrospermopsis and Microcystis.Applied and Environmental Microbiology.2015; 81(15):5203–5211.
- Hayes D and Dobnik D. Commentary: Multiplex dPCR and SV-AUC are promising assays to robustly monitor the critical quality attribute of AAV drug product integrity.Journal of Pharmaceutical Sciences 111(8): 2143–2148.
- Nell RJ et al.Accurate quantification of T Cells in copy number stable and unstable DNA samples using multiplex digital PCR.Journal of Molecular Diagnostics.2022; 24(1):88–100.
- Sanchez MEN et al.Multiplex reverse transcriptase droplet digital PCR for the simultaneous quantification of four dengue serotypes: Proof of concept study.2020; Biologicals 67:62–68.
- Meng P et al.Development of a multiplex dPCR assay for ERBB2 amplification in breast cancer.European Journal of Cancer.2022; 175(1):S80.
- Morisset D, Štebih D, Milavec M, Gruden K, Žel J. Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR.PLoS One.2013; 8(5): e62583.
- Oscorbin IP et al.Multiplex droplet digital PCR assay for detection of MET and HER2 genes amplification in non-small cell lung cancer.Cancers (Basel).2022; 14(6):1458.
- Center for Breakthrough Medicines. https://breakthroughmedicines.com/all/tech-note-high-throughput-aav-viral-titering-using-nanoplate-based-digital-pcr/ (Accessed April 21, 2023)