Guide pour débutants en dPCR – Découvrez des astuces et des ressources utiles pour vous préparer dans votre laboratoire
Les fondamentaux de la dPCR sur nanoplaques
La procédure QIAcuity Nanoplate dPCR comprend trois étapes principales : pipetage et chargement, exécution de l’expérience et analyse des résultats. Sur le fond, le concept est similaire à la qPCR. La grande différence réside dans le gain de précision et de sensibilité tout en conservant le bénéfice de la quantification.
Étape 1 : préparer et charger
En premier lieu, il est important de préparer vos échantillons. Nous vous recommandons de mesurer la quantité d’ADN et la pureté. Selon votre application, vous pouvez aussi tester l’échantillon dans différentes dilutions. Il est plus intéressant d’utiliser des échantillons purs sans trop d’inhibiteurs de PCR. Pour plus d’informations sur la préparation des échantillons, consultez le Guide d’application QIAcuity.
Ensuite, créez une expérience dans la QIAcuity Software Suite en définissant les paramètres de dPCR : amorçage, profils de cycle et d’imagerie, mélanges réactionnels, échantillons et contrôles, disposition des plaques. Une fois la plaque définie, elle est prête pour un cycle. Préparez le mélange réactionnel dans une plaque préalable en regroupant le QIAcuity PCR Master Mix et l’échantillon, les amorces, l’eau sans RNase et éventuellement des enzymes de restriction. Le volume réactionnel final dépend de la QIAcuity Nanoplate utilisée. Le mélange réactionnel préparé peut ensuite être pipetté dans la nanoplaque. Afin d’éviter toute évaporation et contamination, la nanoplaque doit être scellée hermétiquement. Un rouleau permet de fixer la feuille sur la macrostructure de la plaque. La fermeture hermétique de la plaque par application manuelle est importante pour un bon résultat de remplissage. Il est impératif de saisir la plaque au niveau des bords ou par le plateau et de la transporter délicatement vers le QIAcuity, sans la secouer ni la renverser afin que le mélange réactionnel reste au fond du puits. Une fois l’instrument et la suite connectés, tous les modules sont prêts à l’emploi, vous pouvez charger les plaques et lancer le cycle.
Étape 2 : configurer le cycle et amplifier
Une fois la plaque chargée, l’instrument met l’emplacement en surbrillance en bleu puis lit le code-barres. Vous pouvez lier à la plaque l’expérience de votre choix précédemment configurée dans le logiciel de contrôle, définir le profil d’amorçage, de cycle et d’imagerie puis lancer le cycle.
La plaque est d’abord traitée dans le module d’amorçage/roulis. À cette étape, le mélange réactionnel de chaque puits est fractionné en un millier de petites réactions individuelles. Ensuite un thermocycleur effectue la PCR. La matrice qui convient dans une fraction ou une autre entraîne un signal de fluorescence positif, qui est détecté au cours de l’imagerie. Les images sont envoyées à la QIAcuity Software Suite à des fins de traitement.
Vous pouvez voir l’état actuel de la plaque sur l’écran de l’instrument ou dans la suite logicielle.
Étape 3 : analyser les résultats
Pour l’analyse, sélectionnez l’un des éléments suivants : Quantification absolue, Détection des mutations, Édition génomique, Variation du nombre de copies ou Expression génique. Pour l’analyse de quantification absolue, il suffit de sélectionner les puits de votre choix ainsi qu’un canal cible ou de détection. La vue de la liste indique la concentration, l’intervalle de confiance ainsi que les fractions positives et négatives valides. Une vue avec carte de densité indique le canal cible et le canal de référence. Utilisez l’histogramme, le diagramme de dispersion 1D ou le diagramme de dispersion 2D pour modifier les paramètres de seuil. Cliquez sur « Recalculer » pour obtenir des résultats basés sur le seuil ainsi modifié.
Résolution de problèmes et optimisation de la PCR digitale
