Guía de dPCR para principiantes – Encuentre trucos y recursos para aplicar en su laboratorio y ponerse en marcha
Nociones básicas de las nanoplacas Nanoplate dPCR
El flujo de trabajo de QIAcuity Nanoplate dPCR tiene tres pasos básicos: pipeteo y carga, ejecución del experimento y análisis de los resultados. En principio, el concepto es similar al de las qPCR. La diferencia fundamental es una mayor precisión y sensibilidad al mismo coste de cuantificación.
Paso 1: Preparar y cargar
El primer paso es fundamental y consiste en preparar las muestras. Es recomendable medir la cantidad y la pureza del ADN. Según la aplicación concreta, la muestra también puede probarse en distintas diluciones. Utilizar muestras puras sin grandes cantidades de inhibidores de PCR puede resultar muy útil. Para obtener más información sobre la preparación de las muestras, consulte la guía de aplicaciones de QIAcuity.
A continuación, prepare un experimento usando el QIAcuity Software Suite definiendo los parámetros de dPCR, priming, perfil de ciclado e imagen, las mezclas de reacción, muestras y controles, así como la disposición en la placa. Una vez que la placa se haya definido, estará lista para ejecutarse. Prepare la mezcla de reacción en una preplaca combinando la QIAcuity PCR Master Mix con la muestra, los primers, el agua libre de RNasas y, opcionalmente, la enzima de restricción. El volumen de reacción final depende de la QIAcuity Nanoplate empleada. La mezcla de reacción preparada puede pipetearse en la nanoplaca. Para evitar la evaporación y la contaminación, la nanoplaca deberá sellarse adecuadamente. Se utilizará un rodillo para fijar la película de aluminio a la macroestructura de la placa. Es importante sellar la placa manualmente para obtener un resultado óptimo. Es fundamental colocar la placa correctamente orientada respecto a los bordes en la bandeja y transportarla en su base al equipo QIAcuity cuidadosamente, sin agitarla ni girarla para que la mezcla de reacción esté al fondo del pocillo. Cuando el instrumento y la solución se conectan, todos los módulos están listos para usarse y las placas pueden cargarse e iniciarse.
Paso 2: Configuración de proceso y amplificación
Una vez que se carga la placa, el instrumento encenderá la ranura de luz frontal en color azul y escaneará el código de barras. Se puede vincular el experimento preferido configurado previamente en el software de control a la placa, el primer, el termociclado y el perfil de obtención de imágenes definidos e iniciar el proceso.
Primero, la placa se procesará en el módulo de priming/rolling. En este paso, la mezcla de reacción de cada pocillo se divide en miles de reacciones individuales de pequeño tamaño. Posteriormente, la PCR se lleva a cabo en un termociclador. El material del molde adecuado en algunas de las divisiones dará lugar a una señal fluorescente positiva, que se detectará durante la obtención de imágenes. Las imágenes se enviarán al QIAcuity Software Suite para procesarlas.
El estado de cada placa puede consultarse en la pantalla del instrumento o en el Software Suite.
Paso 3: Análisis de los resultados
Para llevar a cabo el análisis, seleccione una de las siguientes opciones: Absolute Quantification (cuantificación absoluta), Mutation Detection (detección de mutaciones), Genome Editing (edición de genomas), Copy Number Variation (variación del número de copias) o Gene Expression (expresión genética). Para el análisis de cuantificación absoluta, seleccione los pocillos que desee y el canal de detección o el de diana. La vista de lista muestra la concentración, el intervalo de confianza y las particiones positivas y negativas. La vista de mapa de calor muestra el canal del gen diana y el de referencia. Utilice el histograma, el diagrama de dispersión 1D o el 2D para cambiar los ajustes de umbral. Haga clic en “recalcular” para obtener resultados una vez que haya modificado el umbral.
Resolución de problemas y optimización de la PCR digital
