멀티플렉스 디지털 PCR

PCR에 멀티플렉싱 기능을 사용하면 단일 반응에서 표적 분자 또는 서열을 두 개 이상 검출할 수 있습니다. 사용되는 형광 물질의 종류를 변경하면 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR)을 사용하는 멀티플렉싱을 수행할 수 있습니다. 기존의 다색 멀티플렉싱에서는 표적당 하나의 프로브를 사용하여 표적을 차별화합니다. 이때 프로브는 다양한 방출 스펙트럼의 염료와 결합됩니다. 대부분의 dPCR 기기는 2개 이상의 전용 검출 채널에서 서로 다른 형광 투시의 검출 기능을 제공합니다. 일부 dPCR 시스템에서는 동일한 반응에서 더 많은 표적을 명확하게 식별하기 위해 5색 멀티플렉싱을 지원합니다.

dPCR의 멀티플렉싱은 dPCR 시스템에서의 다양한 멀티플렉싱의 장점으로 인해 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. 이 접근 방식은 다음과 같이 사용할 수 있습니다.

• 단일 반응에서 여러 표적 분석
• 기술적 오류(예: 부정확한 피펫팅) 감소
• 표적 검출 확률 증가
• 분석에 필요한 검체량 감소
• 개별 반응에 대한 직접적인 내부 대조물질 제공
• 시간과 시약을 절약하여 전체 비용 절감

디지털 PCR을 통한 멀티플렉싱을 사용하면 단일 색상 분석을 통해 수행할 수 없거나 수행하기 쉽지 않은 다양한 공정을 수행할 수 있습니다. 다음은 이러한 분석의 일부입니다.

• 복제수 변이: 듀플렉스 접근 방식으로 표적 유전자와 참조 유전자를 짝지어 비율을 결정합니다
• 단일 뉴클레오티드 변이 또는 작은 삽입/결실의 이중대립형질 변이: 색상 플롯 2개를 사용하여 시각화한 가수분해 프로브 2개를 사용한 듀플렉스 접근 방식(1)
• 유전형: 단일 및 이중 양성 클러스터에서 분획 수 계산(1)

멀티플렉스 반응을 위한 나노플레이트 디지털 PCR의 장점

멀티플렉스 디지털 PCR은 이 방식이 멀티플렉스 qPCR보다 더 유연하고 민감하며 특이하기 때문에 선호되는 접근 방식입니다. qPCR을 통한 멀티플렉싱에는 절댓값 계산에 더 복잡한 방법이 필요할 수 있으며 이 방법은 하나의 반응에서 여러 PCR로 인한 간섭에 더 취약합니다. 

나노플레이트 디지털 PCR은 짧은 실행 시간, 높은 정밀도 및 민감도, 멀티플렉싱 기능 등 다른 디지털 PCR 유형과 차별화된 이점을 제공합니다. 나노플레이트는 대량의 미세방울 분석이 아닌 개별 PCR 반응을 기반으로 하므로 희귀 표적(반응별 복제수가 10~20개 미만임)을 찾을 수 있습니다.

나노플레이트 디지털 PCR은 다양한 검체 기질을 수용할 수 있어 더 많은 아데노 연관 바이러스 생산 단계에서 역가를 계산할 수 있습니다. QIAcuity Digital PCR System에서는 독립된 사용자가 생산성 향상을 위해 다양한 분석을 병렬로 실행할 수 있습니다(29).

• 개별 분석 최적화: dPCR 멀티플렉싱 전에 개별 반응을 검증합니다(예: 이합체 발생 여부 확인)
• 프라이머 및 프로브 평가: 프라이머와 프로브 간에 잠재적 상호 작용이 있는지 확인합니다
• 신중한 염료 선택: 각 분석의 염료를 신중하게 선택하고, 복제 표적을 줄이기 위해 밝은 형광단이 포함된 염료를 선택합니다
• 연결된 표적 확인: 연결된 표적 또는 상위 표적과의 상관관계가 있는지 조사합니다. 예를 들면 연결 기반 분석을 사용하여 표적의 시스 대 트랜스 구성과 잠재적 구조 재배열을 평가합니다
• 교차 혼성화 방지: 가능한 경우 프로브 불일치를 방지하기 위해 두 개 이상의 뉴클레오티드 결실 또는 삽입을 포함하는 프로브-표적 변이를 설계합니다
• 광학적 블리드스루 최소화: 염료의 형광이 둘 이상의 채널에서 관찰될 때 발생합니다. 가능한 경우 복합 염료가 광학 검출 시스템과 일치하도록 하거나 분석 소프트웨어에서 신호 처리 매개변수를 조정하십시오
• 비(rain)의 존재를 줄이기: 비(rain)는 음성 분획보다 높지만 양성 분획보다 낮은 분획의 하위 집합을 나타냅니다. 템플릿 유형, 확인, 무결성, 분석 특이성, 반응에서 억제제의 존재를 재평가하여 비(rain)를 줄일 수 있습니다. 비(rain)가 정량화에 영향을 미치지 않도록 하려면 임계값 위치를 다르게 설정하는 것이 좋습니다

멀티플렉스 디지털 PCR을 수행하는 데 관심이 있는 경우 고급 멀티플렉싱 기능이 포함된 dPCR 기기에 투자하는 것이 좋습니다. 또한 멀티플렉싱 초보자와 전문가 모두에게 다양한 이점을 제공할 수 있는 멀티플렉스 디지털 PCR 분석을 위해 수많은 dPCR 키트와 dPCR 분석이 개발되었습니다.

• 디지털 PCR 기기 – 사용 가능한 디지털 PCR 시스템 유형은 다양하지만 일부 유형은 다른 유형보다 더 많은 멀티플렉싱 옵션을 제공합니다. 예를 들어 QIAcuity dPCR 시스템은 최대 5개 채널(참조 채널 1개 추가)에서 멀티플렉싱할 수 있어 가장 간단한 멀티플렉싱 방법을 제공하고 시간과 시약을 절약할 수 있습니다.

추가 참조 문헌

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