マルチプレックスデジタルPCRとは何ですか？
PCRにおけるマルチプレックスでは、1回の反応で複数のターゲット分子やシークエンスを検出できます。デジタルPCR（dPCR）を用いるマルチプレックスは、使用する蛍光色素の種類を変えることで実現できます。従来のマルチカラーマルチプレックスでは、ターゲットごとに1つのプローブを使用し、発光スペクトルの異なる色素と結合したプローブを用いることでターゲットを区別します。ほとんどのdPCR装置では、少なくとも2つの専用検出チャンネルで異なる蛍光色素を検出します。一部のdPCRシステムでは、5色マルチプレックスにより、同じ反応内でより多くのターゲットを明確に識別できます。
dPCRマルチプレックスの利点
dPCRでのマルチプレックスは、dPCRシステムによるマルチプレックスの利点が多いため、関心が高まっているテーマです。このアプローチは、次のような目的で使用できます：
- 1回の反応で複数のターゲットを分析
- ピペッティングの不正確さなどの技術的エラーを削減
- ターゲット検出の可能性を高める
- 分析に必要なサンプル量を削減
- 個々の反応の直接内部コントロールを提供
- 時間と試薬を節約して、全体的なコストを削減
デジタルPCRによるマルチプレックスでは、シングルカラーアッセイでは不可能、または容易に実行できないいくつかのアプリケーションが可能です。 このような分析には次のようなものがあります。
- コピー数変異：2プレックスのアプローチにより、ターゲット遺伝子とリファレンス遺伝子をペアリングし、その比率を決定
- 一塩基変異や小さな挿入/欠失の二対立遺伝子変異：2つの加水分解プローブを用いる2プレックスのアプローチで、2つのプロットを用いて可視化（1）
- 遺伝子型決定：シングルおよびダブルポジティブクラスターからパーティション数を計数（1）
デジタルPCRマルチプレックスの利点を最大限にするには、高度なマルチプレックス機能を備えたデジタルPCRシステムをご検討ください。
高いマルチプレックス能力を備えたデジタルPCR装置では、1つのサンプルの複数のターゲットを、高い感度と再現性で分析できます。たとえば、QIAcuityデジタルPCRシステムには、サンプルやターゲット分析のニーズに合わせて、いくつかの構成が存在します。
マルチプレックス反応におけるナノプレートデジタルPCRの利点
マルチプレックスデジタルPCRは、マルチプレックスqPCRよりも柔軟性、感度、特異性が高い方法であるため、好ましいアプローチといえます。qPCR によるマルチプレックスでは、絶対値を計算するためにより複雑な方法が必要になる可能性もあり、この方法は1つの反応で複数のPCRの干渉の影響を受けやすくなります。
ナノプレートデジタルPCRは、短いラン時間、高い精度と感度、マルチプレックス機能など、他のタイプのデジタルPCRに比べ、明確な利点を備えています。ナノプレートは、バルクドロップレットの分析ではなく、個々のPCR反応に依存するため、希少なターゲット（<10～20コピー/反応）を見つけることができます。
ナノプレートデジタルPCRはさまざまサンプルマトリックスに対応できるため、AAV生産のより多くのステージでタイター測定が可能です。またQIAcuityデジタルPCRシステムでは、独立したユーザーが複数のアッセイを並行して行い、生産性を高めることもできます（29）。
QIAcuityデジタルPCRシステムのハイスループットおよびマルチプレックス機能
| QIAcuity One | QIAcuity Four | QIAcuity Eight | |
|---|---|---|---|
|
検出チャンネル （マルチプレックス） |
2または5 | 5 | 5 |
|
1就業日に分析するサンプル数 |
最大384 |
最大672 |
最大1248 |
|
推奨色素 |
FAM；VIC、HEX；TAMRA；ROX；Cy5 |
||
5プレックスdPCRデータとは、どのようなものですか？
左図では、dPCR反応のテンプレートインプット量として10 ng（A、上パネル、下パネル）および1 ng（B、上パネル、下パネル）のcDNAを使用しています。QIAcuity One、5プレックスシステムを用いて、QIAcuity Nanoplate 8.5K 96ウェルで5プレックス反応を行い、5つのアッセイターゲット（ERBB2、EGFR、CDKN2A、KDR、CDK1）を測定しました。プローブはそれぞれFAM、HEX、TAMRA、ROX、Cy5で標識しました。 2D散布図は、マルチプレックスセットアップにおける単一アッセイの明確な分離を示しています。
dPCRマルチプレックスに関する初歩的な質問がまだいくつかありますか？弊社のQIAgeniusがお答えできるかもしれません。
マルチプレックスdPCRのアプリケーション
マルチプレックスdPCRアッセイは、さまざまなデジタルPCRアプリケーションをサポートできます。細胞および遺伝子治療から、食品偽装調査、AAV特性評価、微生物検出、コピー数多型アッセイなど、多岐にわたります。
dPCRによるCNV分析について詳しくお知りになりたいですか？
弊社のウェビナー「dPCRを使用するリキッドバイオプシーにおけるコピー数多型のマルチプレックス分析：固形腫瘍患者からの予備データ」をご覧ください。
微生物検出のためのマルチプレックスdPCRに興味をお持ちになりましたか？
そして、ナノプレートdPCRを用いる微生物のDNAおよびRNAターゲットの正確かつ高感度な検出に関する科学ポスターをご覧ください。
マルチプレックスデジタルPCRで正確な定量を行うための留意点
- 個々のアッセイを最適化：dPCRマルチプレックスの前に個々の反応を検証します（たとえば、ダイマーの発生をチェック）
- プライマーとプローブを評価：プライマーとプローブの相互作用の可能性をチェック
- 色素を慎重に選択：各アッセイの色素を慎重に選択。低コピーターゲットには明るい蛍光色素を持つ色素を選択
- リンクしたターゲットをチェック：リンクしたターゲットまたは高次ターゲット相関関係の可能性を調査。たとえば、リンケージベースのアッセイを使用して、ターゲットのシス対トランスの配置や潜在的な構造再配列を測定
- クロスハイブリダイゼーションを回避：可能であれば、プローブのミスマッチを避けるために、2つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入を含むプローブとターゲットのバリエーションを設計
- 光学的な漏れ込みを最小限に抑制：色素の蛍光が複数のチャンネルで拾われる場合に発生。可能であれば、共役色素が光学検出システムに一致していることを確認するか、解析ソフトウェアのシグナル処理パラメーターを調整
- レインの存在を低減：レインとは、陰性パーティションより高いが陽性パーティションより低いパーティションのサブセットを表します。テンプレートの種類、確認、完全性、アッセイ特異性、反応中の阻害物質の存在を再評価することで、レインを減らすことができます。レインが定量に与える影響を避けるため、閾値の位置を変えて設定することを検討します。
dPCRアッセイ最適化のためのその他のヒント
当社のdPCRアッセイ開発ページをご覧になり、dPCR実験の設計、トラブルシューティング、最適化についてさらに洞察を深めてください。
マルチプレックスdPCRを開始する
マルチプレックスデジタルPCRの実施にご関心がある場合は、高度なマルチプレックス機能を備えたdPCR装置への投資をぜひご検討ください。マルチプレックスデジタルPCRアッセイ用に開発された多数のdPCRキットやdPCRアッセイもあり、マルチプレックスの初心者と専門家の両方に数多くのメリットをもたらします。
- デジタルPCR装置 – 利用可能なデジタルPCRシステムには多くの種類がありますが、中には他に比べ、マルチプレックスオプションが豊富なものもあります。たとえば、QIAcuity dPCRシステムは、最大5チャンネル（＋1リファレンスチャンネル）でマルチプレックスが可能で、マルチプレックスし、時間と試薬を節約する最も簡単な方法を提供します：
| チャンネル | 励起（nm） | 発光（nm） | 蛍光色素例 |
|---|---|---|---|
|
グリーン |
463 – 503 |
518 – 548 |
FAM |
|
イエロー |
514 – 535 |
550 – 564 |
HEX, VIC |
|
オレンジ |
543 – 565 |
580 – 606 |
TAMRA, ATTO 550 |
|
レッド |
570 – 596 |
611 – 653 |
ROX, Texas Red |
|
クリムゾン |
590 – 640 |
654 – 692 |
Cy5 |
- 多目的dPCRキット – マルチプレックス反応用に開発されたdPCRキットの使用をご検討ください。QIAcuityプローブPCRキットには、QIAcuityナノプレート上で存在量の大きく異なる最大5つのターゲットを定量することができる特別なマスターミックスが含まれています。dPCRマルチプレックスにより、データの品質や妥当性に影響を与えることなく、時間、コスト、サンプル材料を節約できます。
- コンタミネーションのない分析用のdPCRキット – バックグラウンドDNAの汚染を最小限に抑えるウルトラクリーンなマスターミックスを必要とするアプリケーションには、専用のキットがあります。QIAcuity UCPプローブPCRキットは、微生物分析や残留DNA検査などの品質管理アプリケーションに最適です。このキットは、シングルプレックスまたは5プレックスdPCRアッセイで、gDNAやcDNAの定量に高い特異性と精度を提供します。
- アプリケーション特異的dPCRマルチプレックスアッセイ – 特定のアプリケーションに応じてスループットを向上させ、コストを削減するのため、さまざまな色素（FAM、HEX、ROX、Atto 500、Cy5）を用いるdPCRアッセイを開発しました。このマルチプレックスdPCRアッセイにより、柔軟な実験設計と1回の反応で最大5つのターゲットのマルチプレックス分析が可能です。特定のdPCRアッセイは、CNV解析、微生物検出、細胞および遺伝子治療、がん関連変異のLNA変異アッセイに利用できます。
マルチプレックスデジタルPCRの注目製品
dPCRマルチプレックスに関する出版物
科学界はdPCRマルチプレックスアッセイの利点を全面的に認めています。デジタルPCRマルチプレックスアプローチを使用して発表している研究者のリストをご覧ください。
| アプリケーション | マルチプレックスdPCRの使用 | 参考文献 |
|---|---|---|
|
ヒドロキニンの抗菌 |
排出 |
Rattanachak N, Weawsiangsang S, Jongjitvimol T, |
| 法医学的な 目的で、家庭で一般的に 見られる種の混合物の 定とデコンボリューション |
2つの マルチプレックスでホモサピエンス、イヌ、ネコ、 ウシ、ブタ、魚、ニワトリ類を識別 |
Ghemrawi M and McCord B. Development of a nanoplate-based digital PCR assay for species identification with mixture deconvolution. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 2022; 8:193–195. |
| ベルギーの 流入下水で懸念されるSARS-CoV-2 変異体の検出 |
流入下水中の4種類の懸念変異体（VOC）の 検出と 異なる SARS-CoV-2 VOCのRNA定量を行うためのターゲットマルチプレックスdPCRアッセイ |
Booagaerts T et al. Optimization and application of a multiplex digital PCR assay for the detection of SARS-COV-2 variants of concern in Belgian influent wastewater. Viruses. 2022; 14(3):610. |
| RNAからの 遺伝子融合の検出 |
ASPYREテクノロジーの最初のRT-PCR 反応におけるマルチプレックスプライマーにより、3’遺伝子融合 ファミリー内の 37の潜在的なターゲットを同定 |
Gray ER at al. Ultra-sensitive molecular detection of gene fusions from RNA using ASPYRE. BMC Medical Genomics. 2022; 15:215. |
マルチプレックスdPCRに関するその他のリソース
その他の参考文献
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