¿Qué es una PCR digital múltiple o multiplex?
El multiplexado en la PCR permite detectar más una molécula diana o secuencia diana en una sola reacción. El multiplexado con PCR digital (dPCR) puede obtenerse variando el tipo de fluoróforos utilizados. En el multiplexado multicolor tradicional, los elementos diana se diferencian utilizando una sonda por elemento diana en el cual la sonda se conjuga con colorantes de diferentes espectros de emisión. La mayoría de los instrumentos de dPCR ofrecen la detección de diferentes fluoróforos en al menos dos canales de detección dedicados. Algunos sistemas de dPCR permiten el multiplexado de 5 colores para diferenciar claramente más elementos diana en la misma reacción.
Ventajas del multiplexado de dPCR
El multiplexado en la dPCR es un tema que cada vez genera más interés, debido a los numerosos beneficios del multiplexado con un sistema de dPCR. El método se puede utilizar para:
- Analizar varios elementos diana en una sola reacción
- Reducir los errores técnicos, como las inexactitudes del pipeteado
- Aumentar las posibilidades de detección de elementos diana
- Reducir la cantidad de muestra necesaria para el análisis
- Proporcionar un control interno directo de una reacción individual
- Ahorrar tiempo y reactivos para reducir el coste total
El multiplexado con PCR digital habilita varias aplicaciones que no son posibles o no son fáciles de realizar mediante ensayos de un solo color. Algunos de estos análisis incluyen:
- Variantes en el número de copias: con un método duplex, emparejamiento de genes diana y de referencia para determinar su relación
- Variación bialélica de variantes de un solo nucleótido o inserciones/eliminaciones pequeñas: método doble con dos sondas de hidrólisis, visualizadas con diagramas de dos colores (1)
- Genotipado: recuento de cantidades de divisiones de grupos de positivo simple y doble (1)
Un instrumento de PCR digital con alta potencia de multiplexado le permite analizar varios elementos diana en una sola muestra con sensibilidad y reproducibilidad elevadas. Por ejemplo, el QIAcuity Digital PCR System ofrece varias configuraciones que se adaptan a sus necesidades para el análisis de muestras y elementos diana.
La ventaja de la PCR digital basada en nanoplacas para las reacciones múltiples
La PCR digital múltiple es un enfoque preferido, ya que el método es más flexible, sensible y específico que la qPCR múltiple. El multiplexado de la qPCR también podría requerir métodos más complicados para calcular los valores absolutos y el método es más susceptible a la interferencia de múltiples PCRs en una reacción.
La PCR digital basada en nanoplacas ofrece distintas ventajas respecto de los otros tipos de PCR digital, entre las que se incluyen precisión y sensibilidad elevadas, así como capacidades de multiplexado. Dado que las nanoplacas dependen de reacciones de PCR individuales, en lugar del análisis de gotas masivo, es posible encontrar elementos diana poco frecuentes (<10-20 copias/reacción).
La PCR digital basada en nanoplacas puede albergar diversas matrices de muestras, lo que permite realzar una valoración en más etapas de la producción de AVV. El QIAcuity Digital PCR System también permite a los usuarios independientes realizar varios ensayos en paralelo para aumentar la productividad (29).
Características de alto rendimiento y multiplexado del QIAcuity Digital PCR System
| QIAcuity One | QIAcuity Four | QIAcuity Eight | |
|---|---|---|---|
|
Canales de detección (multiplexado) |
2 o 5 | 5 | 5 |
|
Número de muestras analizadas en una jornada de trabajo |
Hasta 384 |
Hasta 672 |
Hasta 1248 |
|
Colorantes recomendados |
FAM; VIC, HEX; TAMRA; ROX; Cy5 |
||
¿Qué aspecto tienen los datos de una dPCR 5 plex?
En la figura de la izquierda se utilizaron 10 ng (A, paneles superior e inferior) y 1 ng (B, paneles superior inferior) de ADNc como cantidad de entrada del molde para la reacción de dPCR. Se midieron cinco elementos diana del ensayo (ERBB2, EGFR, CDKN2A, KDR y CDK1) en una reacción 5 plex en un QIAcuity Nanoplate 8.5K de 96 pocillos utilizando QIAcuity One, 5plex System. Las sondas estaban marcadas con FAM, HEX, TAMRA, ROX y Cy5, respectivamente. Los diagramas de dispersión 2D muestran una clara separación de los ensayos simples en una configuración múltiple.
Aplicaciones de dPCR múltiple
Consideraciones sobre la cuantificación exacta con PCR digital múltiple
- Optimizar ensayos individuales: Valide reacciones individuales antes del multiplexado de dPCR (por ejemplo, compruebe la presencia de dímeros)
- Evaluar cebadores y sondas: Compruebe la posible interacción entre los primers y las sondas
- Seleccionar cuidadosamente los colorantes: Elija los colorantes para cada ensayo cuidadosamente, seleccione colorantes con un fluoróforo brillante para elementos diana con bajo número de copias
- Comprobar la existencia de elementos diana ligados: Investigue el potencial de los elementos diana ligados o las correlaciones de elementos diana de orden superior; por ejemplo, utilice ensayos basados en enlaces para medir la configuración de cis frente a trans de los elementos diana y los posibles reordenamientos estructurales
- Evitar la hibridación cruzada: Si es posible, diseñe variaciones de sonda hacia el elemento diana que incluyan cambios en dos o mas bases o inserciones de nucleótidos para evitar discordancias en las sondas
- Minimiza la filtración óptica: se produce si más de un canal recoge la fluorescencia de un colorante; si es posible, trate de asegurarse de que los colorantes conjugados coincidan con los sistemas de detección óptica o ajuste los parámetros de procesamiento de señales en el software de análisis
- Reducir la presencia de efecto de lluvia o nieve: El efecto de lluvia describe el subconjunto de particiones que son superiores a las particiones negativas pero inferiores a las positivas. Puede reducir el efecto de lluvia reevaluando el tipo de molde, la confirmación, la integridad, la especificidad del ensayo y la presencia de inhibidores en la reacción; considere ajustar la posición de umbral de otra manera para evitar la influencia de la lluvia en la cuantificación
Comenzar con la dPCR múltiple
Si le interesa realizar una PCR digital múltiple, considere la posibilidad de invertir en un instrumento de dPCR con capacidades de multiplexado avanzadas. Existen varios kits de dPCR y ensayos de dPCR desarrollados para los ensayos de PCR digital múltiple que podrían aportar varios beneficios, tanto a principiantes como a expertos en multiplexado.
- Su instrumento de PCR digital – Existen muchos tipos de sistemas de PCR digital disponibles, pero algunos ofrecen más opciones de multiplexado que otros. Por ejemplo, el sistema de dPCR QIAcuity ofrece la posibilidad de multiplexar en hasta 5 canales (más un canal de referencia), lo que proporciona la forma más simple de multiplexar y ahorrar tiempo y reactivos:
| Canal | Excitación (nm) | Emisión (nm) | Fluoróforos de ejemplo |
|---|---|---|---|
|
Verde |
463 – 503 |
518 – 548 |
FAM |
|
Amarillo |
514 – 535 |
550 – 564 |
HEX, VIC |
|
Naranja |
543 – 565 |
580 – 606 |
TAMRA, ATTO 550 |
|
Rojo |
570 – 596 |
611 – 653 |
ROX, Texas Red |
|
Carmín |
590 – 640 |
654 – 692 |
Cy5 |
- Sus kits de dPCR multifuncionales – Considere usar kits de dPCR desarrollados para reacciones múltiples. Los QIAcuity Probe PCR Kits incluyen mezclas maestras especiales para cuantificar hasta cinco elementos diana de abundancia muy diversa en una QIAcuity Nanoplate. El multiplexado de dPCR le permite ahorrar tiempo, costes y material de muestra sin afectar la calidad o la validez de los datos.
- Kits de dPCR para análisis sin contaminación – Existen kits especializados para aplicaciones que requieren mezclas maestras ultralimpias que minimizan la contaminación del ADN de fondo. El QIAcuity UCP Probe PCR Kit es ideal para el análisis microbiano o para las aplicaciones de control de calidad, como las pruebas de ADN residual. Los kits ofrecen especificidad y exactitud elevadas en la cuantificación de ADNg o ADNc en ensayos de dPCR simple o 5 plex.
- Ensayos de dPCR múltiple específicos de la aplicación – Para aumentar el rendimiento y reducir los costes de acuerdo con aplicaciones específicas, se han desarrollado ensayos de dPCR con diferentes colorantes (FAM, HEX, ROX, Atto 500 y Cy5). Estos ensayos de dPCR múltiple permiten el diseño experimental flexible y el análisis múltiple de hasta cinco elementos diana en una reacción. Se encuentran disponibles ensayos de dPCR específicos para análisis de CNV, detección de microbios, terapia celular y génica y ensayos de mutación LNA para mutaciones relacionadas con el cáncer.
Productos destacados para la PCR digital múltiple
Publicaciones con multiplexado de dPCR
| Aplicación | Uso de dPCR múltiple | Referencias |
|---|---|---|
|
Investigation of the antimicrobial |
Multiplex reverse transcription digital PCR |
Rattanachak N, Weawsiangsang S, Jongjitvimol T, |
| Identification and deconvolution of mixtures of species commonly found in households for forensic purposes |
Identified Homo sapiens, canine, feline, bovine swine, pisces, and gallus in two multiplexes |
Ghemrawi M and McCord B. Development of a nanoplate-based digital PCR assay for species identification with mixture deconvolution. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 2022; 8:193–195. |
| Detection of SARS-CoV-2 Variants of Concern in Belgian Influent Wastewater |
Targeted multiplex dPCR assay for detection of four different Variants of Concern (VOC) and quantification of the RNA from different SARS-CoV-2 VOC in influent wastewater |
Booagaerts T et al. Optimization and application of a multiplex digital PCR assay for the detection of SARS-COV-2 variants of concern in Belgian influent wastewater. Viruses. 2022; 14(3):610. |
| Detection of gene fusions from RNA |
Multiplexed primers in initial RT-PCR reaction in ASPYRE technology to identify 37 potential targets within the 3’ gene fusion families |
Gray ER at al. Ultra-sensitive molecular detection of gene fusions from RNA using ASPYRE. BMC Medical Genomics. 2022; 15:215. |
Más recursos sobre dPCR múltiple
Otras referencias
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