
什么是多重数字 PCR?
PCR 的多重检测能够在单个反应中检测多种靶标分子或序列。可通过改变使用的荧光基团种类来实现数字 PCR (dPCR) 的多重检测。在传统的多色多重检测中,每个靶标使用一种探针进行区分,探针与具有不同发射光谱的染料相结合。大多数 dPCR 仪器能够至少提供两个检测通道,进而对不同荧光基团进行检测。例如,QIAcuity Digital PCR System 可在同一反应中进行多重检测,从而在一个反应中清晰地区分 12 个靶标。
dPCR 多重检测的优势
得益于使用 dPCR 系统进行多重检测的诸多益处,dPCR 的多重检测已经成为人们日益感兴趣的话题。该方法可用于:
- 在单个反应中分析多个靶标
- 减少技术错误,例如移液不准确
- 增加靶标检测的机会
- 减少分析所需的样本量
- 提供单个反应的直接内部对照
- 节省时间和试剂以降低总成本
使用数字 PCR 进行多重检测可以实现单重检测不可能或不容易执行的多种应用。 这些应用包括:
- 拷贝数变异:采用双重检测方法,将靶标基因和参比基因配对以确定其比例
- 单核苷酸变异或小片段插入/缺失变异:具有两种水解探针的双重检测方法,使用两种彩色图进行可视化 (1)
- 基因分型:计算单阳性和双阳性反应分区数 (1)
具有高重检测能力的数字 PCR 仪器,使您能够以更高的灵敏性和重复性对一个样本中的多个靶标进行分析。例如,QIAcuity Digital PCR System 具有多种配置,可满足您对样本和靶标分析的需求。
使用纳米微孔板数字 PCR 进行多重反应的优势
多重数字 PCR 是首选的方法,因为它比多重 qPCR 具有更高的灵活性、灵敏性和特异性。通过 qPCR 进行多重检测可能需要更复杂的方法来计算绝对值,并且该方法更易受到一个反应中进行多个 PCR 的干扰。 借助自定义串扰矩阵等软件功能,您可以根据检测和运行参数处理相邻通道之间的串扰信号。与 qPCR 相比,这有助于进一步提高 dPCR 多重检测能力和数据准确性。
与其他数字 PCR 类型相比,纳米微孔板数字 PCR 具有明显的优势,包括运行时间短、精确度和灵敏度高以及高阶多重检测选项,包括幅度多重检测。
QIAcuity 仪器提供六种颜色,可用于六个通道和两个杂合体通道的靶标检测。这些杂合体通道用于长斯托克斯位移 (LSS) 染料。这些染料如何工作?与标准荧光染料相比,LSS 染料吸收光与发射光之间的光谱偏移更长。这意味着吸收和发射由不同的通道处理 – 例如,使用标准绿色通道的波长进行激发,而使用黄色滤光片进行发射/图像采集。这可以促进最多 8 重反应的分析。
如需更多靶标,可以尝试高阶多重检测。借助 QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kit, 您可以在 QIAcuity 上进行幅度多重检测,分析多达 12 个靶标。幅度多重检测同时量化同一颜色通道中的两个靶标,有效地将每个反应的数据输出量增加一倍。QIAcuity 软件(3.1 及更高版本)通过在通道内引入三个可调阈值来区分靶标一、靶标二和双阳性,从而支持幅度多重检测。使用这些阈值,您可以分析样本中每个靶标的扩增。
先进的高阶多重检测功能可优化实验室资源,并提供高分辨率的基因变异视图。这些功能对于拷贝数变异和微生物检测等应用至关重要,尤其是在样本有限的情况下。
QIAcuity 系列的主要特点
用于非临床研究的 QIAcuity* Digital PCR System 和用于体外诊断的 QIAcuityDx** Digital PCR System 的高通量和多重检测功能
QIAcuity* One 2plex | QIAcuity* One 5plex | QIAcuity* Four | QIAcuity* Eight | QIAcuityDx** Four | |
---|---|---|---|---|---|
检测通道 | 2 | 8a (6+2 混合b) | 8a | 8a | 5 |
多重检测能力 | 4 | 12c,a | 12c,a | 12c,a | 5 |
单个工作日内分析样本数量 | 最多 384 | 最多 384 | 最多 672 | 最多 1248 | 最多 672(96 孔)d 最多 168(24 孔) |
目的 | 非临床应用 | IVD 应用 |
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多重 dPCR 的应用
使用多重数字 PCR 进行准确定量的注意事项
- 优化单个检测方案:在 dPCR 多重检测之前验证单个反应(如二聚体)
- 评估引物和探针:检查引物和探针之间的潜在相互作用
- 精心挑选染料:精心挑选每个探针的染料;为低拷贝靶标选择具有明亮荧光基团的染料
- 检查连锁基因:调查基因连锁或高阶相关性;例如,使用基于连锁的检测来测量靶标的顺式与反式构型以及潜在的结构重排
- 避免交叉杂交:如有可能,可设计包含两个或多个核苷酸缺失或插入的探针-靶标变异,以避免探针不匹配
- 最大限度减少光学串扰:如果某种染料的荧光信号被多个通道所采集,则会发生光学串扰;如有可能,请尽量确保共轭染料与光学检测系统相匹配,或者在分析软件中调整信号处理参数
- 解决串扰问题:检查您的系统是否具有专门的软件功能,如自定义串扰矩阵,它可以帮助分析所有多重检测中相邻通道之间的串扰,提高数据的可信度
- 减少雨滴现象:雨滴现象描述了高于阴性反应分区但低于阳性反应分区的反应分区子集。您可以通过重新评估模板类型、确认、完整性、引物探针特异性以及反应中抑制物来减少雨滴现象;考虑设置不同的阈值,以避免雨滴现象对定量的影响
开始使用多重 dPCR
通道 | 激发 (nm) | 发射 (nm) | 荧光基团示例 |
---|---|---|---|
绿色 | 463 – 503 | 519 – 549 | FAM™、EvaGreen® |
黄色 | 513–534 | 551–565 | HEX™、VIC® |
橙色 | 541–563 | 582–608 | TAMRA™、Atto 550 |
红色 | 568–594 | 613–655 | ROX™、Texas Red® |
深红色 | 588–638 | 656–694 | Cy5®、Quasar 680 |
远红 | 651-690 | 709-759 | Cy5.5、Atto 680、Atto 700 |
绿色/黄色 | 463–503 | 551–565 | DY-482XL (LSS G/Y)* |
橙色/红色 | 541–563 | 613–655 | DY-540XL (LSS O/R)* |
- 您的多用途 dPCR 试剂盒–考虑使用为多重反应开发的 dPCR 试剂盒。 QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kit 适用于具有挑战性的样本和超过五个靶标的多重检测。QIAcuity Probe PCR Kit 内含特殊的预混液,可在 QIAcuity 纳米微孔板上同时定量丰度相差较大的五个靶标。dPCR 多重检测能够在不影响数据质量或有效性的情况下节省时间、成本和样本。
- 用于无污染分析的 dPCR 试剂盒 – 专用于需要超洁净预混液应用的试剂盒,可最大限度减少污染性背景 DNA。QIAcuity UCP Probe PCR Kit 是微生物分析或质量控制应用(如残留 DNA 检测)的理想选择。该试剂盒具有高度特异性和准确性,可在单重或 5 重 dPCR 检测中定量 gDNA 或 cDNA。
- 特定应用的 dPCR 多重检测 – 为提高特定应用通量并降低成本,已开发出使用不同荧光染料(FAM、HEX、ROX、Atto 500 和 Cy5)的 dPCR 检测。这些多重 dPCR 检测能够在一个反应中对多达五个靶标进行灵活的实验设计和多重分析。特定 dPCR 检测可用于 CNV 分析、微生物检测、细胞和基因治疗以及癌症相关的突变检测。
多重数字 PCR 的重点产品
dPCR 多重检测发表文献
关于多重 dPCR 的更多资源
更多参考文献
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