数字 PCR

多重数字 PCR

什么是多重数字 PCR？

PCR 的多重检测能够在单个反应中检测多种靶标分子或序列。可通过改变使用的荧光基团种类来实现数字 PCR (dPCR) 的多重检测。在传统的多色多重检测中，每个靶标使用一种探针进行区分，探针与具有不同发射光谱的染料相结合。大多数 dPCR 仪器能够至少提供两个检测通道，进而对不同荧光基团进行检测。例如，QIAcuity Digital PCR System 可在同一反应中进行多重检测，从而在一个反应中清晰地区分 12 个靶标。

dPCR 多重检测的优势

得益于使用 dPCR 系统进行多重检测的诸多益处，dPCR 的多重检测已经成为人们日益感兴趣的话题。该方法可用于：

在单个反应中分析多个靶标
减少技术错误，例如移液不准确
增加靶标检测的机会
减少分析所需的样本量
提供单个反应的直接内部对照
节省时间和试剂以降低总成本

使用数字 PCR 进行多重检测可以实现单重检测不可能或不容易执行的多种应用。这些应用包括：

拷贝数变异：采用双重检测方法，将靶标基因和参比基因配对以确定其比例
单核苷酸变异或小片段插入/缺失变异：具有两种水解探针的双重检测方法，使用两种彩色图进行可视化 (1)
基因分型：计算单阳性和双阳性反应分区数 (1)

为了获得数字 PCR 多重检测的全部益处，请考虑使用具有高级多重检测功能的数字 PCR 系统。

具有高重检测能力的数字 PCR 仪器，使您能够以更高的灵敏性和重复性对一个样本中的多个靶标进行分析。例如，QIAcuity Digital PCR System 具有多种配置，可满足您对样本和靶标分析的需求。

使用纳米微孔板数字 PCR 进行多重反应的优势

多重数字 PCR 是首选的方法，因为它比多重 qPCR 具有更高的灵活性、灵敏性和特异性。通过 qPCR 进行多重检测可能需要更复杂的方法来计算绝对值，并且该方法更易受到一个反应中进行多个 PCR 的干扰。借助自定义串扰矩阵等软件功能，您可以根据检测和运行参数处理相邻通道之间的串扰信号。与 qPCR 相比，这有助于进一步提高 dPCR 多重检测能力和数据准确性。

与其他数字 PCR 类型相比，纳米微孔板数字 PCR 具有明显的优势，包括运行时间短、精确度和灵敏度高以及高阶多重检测选项，包括幅度多重检测。

QIAcuity 仪器提供六种颜色，可用于六个通道和两个杂合体通道的靶标检测。这些杂合体通道用于长斯托克斯位移 (LSS) 染料。这些染料如何工作？与标准荧光染料相比，LSS 染料吸收光与发射光之间的光谱偏移更长。这意味着吸收和发射由不同的通道处理 – 例如，使用标准绿色通道的波长进行激发，而使用黄色滤光片进行发射/图像采集。这可以促进最多 8 重反应的分析。

如需更多靶标，可以尝试高阶多重检测。借助 QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kit，您可以在 QIAcuity 上进行幅度多重检测，分析多达 12 个靶标。幅度多重检测同时量化同一颜色通道中的两个靶标，有效地将每个反应的数据输出量增加一倍。QIAcuity 软件（3.1 及更高版本）通过在通道内引入三个可调阈值来区分靶标一、靶标二和双阳性，从而支持幅度多重检测。使用这些阈值，您可以分析样本中每个靶标的扩增。

先进的高阶多重检测功能可优化实验室资源，并提供高分辨率的基因变异视图。这些功能对于拷贝数变异和微生物检测等应用至关重要，尤其是在样本有限的情况下。

QIAcuity 系列的主要特点

用于非临床研究的 QIAcuity* Digital PCR System 和用于体外诊断的 QIAcuityDx** Digital PCR System 的高通量和多重检测功能

	*QIAcuity One 2plex**	*QIAcuity One 5plex**	*QIAcuity Four**	*QIAcuity Eight**	QIAcuityDx Four**
检测通道	2	8^a（6+2 混合^b）	8^a（6+2 混合^b）	8^a（6+2 混合^b）	5
多重检测能力	4	12^c,a	12^c,a	12^c,a	5
单个工作日内分析样本数量	最多 384	最多 384	最多 672	最多 1248	最多 672（96 孔）^d 最多 168（24 孔）
目的	非临床应用				IVD 应用

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多重 dPCR 的应用

多重 dPCR 检测可以支持各种数字 PCR 应用。这些应用包括细胞和基因治疗、食品造假调查、AAV 表征、微生物检测以及拷贝数变异分析。

多重 dPCR 检测用于食品应用

多重数字 PCR 检测在食品行业中具有众多用途。在食品监管控制和质量保证方面，多重 dPCR 检测可用于识别动物物种，检测肉类和肉制品、鱼类和其他物种的源性 (2, 3)。例如，通过数字 PCR 多重检测，您可以在一个反应中成功分辨猪、骆驼、绵羊、驴、山羊、牛和鸡的源性 (2)。

dPCR 多重检测用于 GMO 鉴定以及转基因定量（通过转基因与内源基因的多重 PCR 反应实现）(4, 27)。在一项研究中，使用双重 dPCR 检测分析了玉米饲料样本中 MON810 转基因与 HMG 参比基因的含量。相较于 qPCR 检测，多重 dPCR 检测以其更好的重复性及对种子粉末抑制剂的耐受性，实现了 5 个靶标 DNA 拷贝数的灵敏检测 (5)。

食品欺诈是使用数字 PCR 进行多重检测的另一个主要应用，例如，用于检测加工素食或纯素食产品中的动物源性成分。基于线粒体细胞色素 b 基因（大多数动物特有）和叶绿体 DNA（植物物种特有）的多重 dPCR 检测，可用于素食中的动物源性成分分析 (6)。

最后， dPCR 可用于检测严重食源性疾病。通过数字 PCR 进行多重检测，您可以同时检测多种微生物病原体，例如 E. coli、 L. monoytogenes、 S. Aureus 和 S. enetrica (7)。

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多重 dPCR 用于拷贝数变异分析

在拷贝数变异分析中，通过 dPCR 进行多重检测可实现靶标基因和参比基因配对，进而确定其比例。

在一项研究中，数字 PCR 多重检测被成功用于同时检测基因突变、基因融合和基因重复 (8)。同时使用两个正常的二倍体参比基因对神经母细胞瘤中两种主要癌基因进行拷贝数评估，节省宝贵的样本。多重 dPCR 检测在同时检测基因突变、基因融合和基因重复方面显示出 100% 的特异性和灵敏性 (9)。

使用 dPCR 多重检测进行拷贝数变异分析的另一个例子是脊髓性肌萎缩 (SMA) 样本的基因分型。研究者使用数字 PCR 多重检测，定量 SMN1 和 SMN2 拷贝数，并使用 RPPH1 作为内参基因对照 (10)。研究还表明，数字 PCR 多重检测可用于准确且经济高效地检测 BRCA1 基因中的较大缺失和重复 (11)，以及非小细胞肺癌 (NSCLC) 中的 MET 和 HER2 扩增 (28)。

另一项研究开发并优化了多重 dPCR 检测，用于定量正常和鳞状细胞癌 (SCC) 冷冻样本中 15 种基因组 DNA 生物标记物的拷贝数改变 (CNA) (12)。

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使用多重 dPCR 检测进行突变定量

通过 dPCR 对 DNA 靶标进行多重检测，有利于体细胞突变定量、绝对等位基因定量以及罕见突变检测。研究表明，多重 dPCR 检测套组可用于游离 DNA (cfDNA) (13) 和血浆 (14, 15) 中癌基因突变的定量分析。

有证据表明，在单重反应中找到最佳的引物和探针浓度以及延伸温度是值得的。您还应该检查引物组的兼容性以及双重反应中是否存在雨滴现象。然后，您可以在更复杂的多重 dPCR 反应中进行组合。

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dPCR 多重检测用于微生物检测

数字 PCR 多重检测经常用于检测微生物物种。例如，多重 dPCR 检测可以快速检测细菌病原体、真菌病原体、病毒病原体以及相关耐药性基因 (16, 17, 18, 19, 20)。已报道的检测灵敏度低至 50 拷贝单位/mL，其中一项研究报告称，dPCR 检测血液内细菌 DNA 的灵敏度比 qPCR 高 104 倍 (21)。

另一份文章中开发了双重 dPCR 和双重 qPCR 检测，以评估自然环境中的蓝藻物种。作者发现，虽然 qPCR 快速且经济，但 dPCR 能够提供更高的准确性、精确性以及对 PCR 抑制剂的耐受性 (22)。

靶标之间的抑制和竞争是多重 qPCR 面临的主要挑战，尤其是对于环境样本，其中靶标含量较少，而且具有大量非靶标背景 DNA。现已证明，数字 PCR 多重检测能够准确定量至少浓度相差 1000 倍的两个靶标，为破解 qPCR 的局限性提供了可行的解决方案 (22)。

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多重 dPCR 检测在生物制药中的应用

在生物制药行业，dPCR 多重检测支持单克隆抗体 (MAB)、疫苗、细胞和基因治疗以及生物仿制药的生产和质量控制 (23, 24, 25, 26)。多重 dPCR检测可以提供从污染物检测到效价定量的多个方面质量控制。该方法可以同时检测多种污染物，进而实现高效的质量控制。

与管家基因相比，通过 dPCR 进行多重检测非常适合需要对靶标进行准确相对定量的应用，或者如果正在开发的载体提供多个治疗基因及沉默基因或基因编辑功能。使用患者样本开展研究的研究人员还能够从单个样本中获得更多信息，无需重复采样，并且减少人为错误和每次反应的试剂成本。

使用多重数字 PCR 进行准确定量的注意事项

优化单个检测方案：在 dPCR 多重检测之前验证单个反应（如二聚体）
评估引物和探针：检查引物和探针之间的潜在相互作用
精心挑选染料：精心挑选每个探针的染料；为低拷贝靶标选择具有明亮荧光基团的染料
检查连锁基因：调查基因连锁或高阶相关性；例如，使用基于连锁的检测来测量靶标的顺式与反式构型以及潜在的结构重排
避免交叉杂交：如有可能，可设计包含两个或多个核苷酸缺失或插入的探针-靶标变异，以避免探针不匹配
最大限度减少光学串扰：如果某种染料的荧光信号被多个通道所采集，则会发生光学串扰；如有可能，请尽量确保共轭染料与光学检测系统相匹配，或者在分析软件中调整信号处理参数
解决串扰问题：检查您的系统是否具有专门的软件功能，如自定义串扰矩阵，它可以帮助分析所有多重检测中相邻通道之间的串扰，提高数据的可信度
减少雨滴现象：雨滴现象描述了高于阴性反应分区但低于阳性反应分区的反应分区子集。您可以通过重新评估模板类型、确认、完整性、引物探针特异性以及反应中抑制物来减少雨滴现象；考虑设置不同的阈值，以避免雨滴现象对定量的影响

dPCR 检测优化的更多技巧

浏览 dPCR 检测开发页面，获得更多关于 dPCR 实验设计、故障排除和优化的建议。

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开始使用多重 dPCR

如果您对多重数字 PCR 感兴趣，请考虑投资具有高级多重检测功能的数字PCR 仪器。同时，大量用于多重数字 PCR 检测的 dPCR 试剂盒和 dPCR 检测，可为初学者和专家带有益处。

您的数字 PCR 仪器 – 有多种类型的数字 PCR 系统可供选择，但部分系统提供更多重数检测选项。使用 QIAcuity dPCR 系统，您可以在多达六个标准通道和两个用于 LSS 染料的杂合体通道中进行多重检测，从而建立 8 重检测。如果使用标准通道进行幅度多重检测，则可以将 QIAcuity 的多重检测能力提高到 12 重。

通道	激发 (nm)	发射 (nm)	荧光基团示例
绿色	463 – 503	519 – 549	FAM™、EvaGreen^®
黄色	513–534	551–565	HEX™、VIC^®
橙色	541–563	582–608	TAMRA™、Atto 550
红色	568–594	613–655	ROX™、Texas Red^®
深红色	588–638	656–694	Cy5^®、Quasar 680
远红	651-690	709-759	Cy5.5、Atto 680、Atto 700
绿色/黄色	463–503	551–565	DY-482XL (LSS G/Y)*
橙色/红色	541–563	613–655	DY-540XL (LSS O/R)*

您的多用途 dPCR 试剂盒–考虑使用为多重反应开发的 dPCR 试剂盒。 QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kit 适用于具有挑战性的样本和超过五个靶标的多重检测。QIAcuity Probe PCR Kit 内含特殊的预混液，可在 QIAcuity 纳米微孔板上同时定量丰度相差较大的五个靶标。dPCR 多重检测能够在不影响数据质量或有效性的情况下节省时间、成本和样本。
用于无污染分析的 dPCR 试剂盒 – 专用于需要超洁净预混液应用的试剂盒，可最大限度减少污染性背景 DNA。QIAcuity UCP Probe PCR Kit 是微生物分析或质量控制应用（如残留 DNA 检测）的理想选择。该试剂盒具有高度特异性和准确性，可在单重或 5 重 dPCR 检测中定量 gDNA 或 cDNA。
特定应用的 dPCR 多重检测 – 为提高特定应用通量并降低成本，已开发出使用不同荧光染料（FAM、HEX、ROX、Atto 500 和 Cy5）的 dPCR 检测。这些多重 dPCR 检测能够在一个反应中对多达五个靶标进行灵活的实验设计和多重分析。特定 dPCR 检测可用于 CNV 分析、微生物检测、细胞和基因治疗以及癌症相关的突变检测。