QIAGEN阴离子交换树脂

QIAGEN plasmid kit anion-exchange tips
用QIAGEN的阴离子交换树脂实现简便的质粒纯化
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QIAGEN-tip采用独特的阴离子交换树脂专利技术,无需昂贵的设备和试剂,如超速离心机、HPLC/FPLC或CsCl。并且无需使用毒性或诱变性物质,如苯酚、氯仿和溴化乙锭。QIAGEN树脂的纯化反应主要基于DNA主链上的负电性磷酸基团与正电性的DEAE基团之间的相互作用。缓冲液所使用的盐浓度与pH条件决定了DNA在柱上的结合或解离过程。QIAGEN阴离子交换树脂技术的关键优势在于其优异的高电荷密度。这些树脂由大小为100 µm的二氧化硅离子所组成,粒子间孔径较大,并覆有亲水表面。更大的表面积为DNA的结合提供了密集的DEAE基团。在很宽的盐浓度范围内,质粒DNA均能紧密结合于DEAE基团之上。对于QIAGEN树脂中如RNA、蛋白质、糖类和小型代谢物等的一类杂质可使用中盐缓冲液进行洗涤,而不会对结合的质粒DNA产生影响;后者最后将通过高盐缓冲液得到洗脱。QIAGEN树脂的工作范围极为广泛,可适应从0.1 M到1.6 M之间的不同盐浓度,这使DNA得以从RNA及其他杂质中有效分离出来。与此形成鲜明对照的是,传统上基于纤维素、葡聚糖或琼脂糖的阴离子交换器仅能工作于最高0.4 M的盐浓度下,因此相关物质的结合与洗脱过程都被限制在一段很窄的盐浓度范围内进行。这意味着蛋白、RNA和DNA之间的洗脱峰将很大程度上形成相互重叠,无法完成有效分离。因此,QIAGEN树脂的分离效果与纯化质量,以及操作便利性,都要优于传统阴离子交换树脂。
纯度和生物活性
QIAGEN树脂所制备的核酸纯度不低于两轮CsCl梯度法所提纯的核酸。使用QIAGEN-tip所制备的DNA通过了限制性内切酶、聚合酶(包括Taq DNA聚合酶)、DNA连接酶、磷酸酶和激酶的相关测试。在如转染、转化、测序、克隆机体外转录和翻译等的后续应用中均获得理想表现。

结合与回收效率
QIAGEN-tip的不同名称指示了其对双链质粒DNA的结合能力(以µg为单位),该结合能力是以pUC18质粒DNA作为参考确定的。例如QIAGEN-tip 100就能够结合100 µg质粒DNA。QIAGEN树脂对于不同种类的核酸具有差异性的结合能力。例如QIAGEN树脂对于RNA的结合能力即为质粒DNA的两倍。相反的,对于如λDNA、科斯质粒和基因组DNA等一类较长的核酸而言,其结合能力要略微弱于质粒DNA。在对核酸的产率进行预期时,须考虑到树脂的结合能力与核酸分子量大小之间的关系。

稳定性
QIAGEN树脂在平衡之后其性能稳定的时间可达6小时。超过此时间段之后,树脂的分选特性开始发生变化,不再如之前一般有效。对于同一样品,QIAGEN-tip可在6小时之内反复使用,只需在第一次洗脱步骤之后使用QBT缓冲液对树脂进行重新平衡即可。在如SDS一类的阴离子去垢剂存在的情况下,或低于4.0的pH条件下,QIAGEN树脂将失去效力。

缓冲液
QIAGEN树脂的结合、洗涤和洗脱条件受到pH条件的强烈影响。本图显示了pH值对洗脱各种核酸时所需的盐浓度的影响。对于给定盐浓度的缓冲液,如果其偏离适当的pH值,则会导致目的核酸产率的下降。对应于指定的pH条件,可使用MOPS、磷酸钠、Tris•Cl和醋酸钠等缓冲液。MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸,pKa 7.2)是QIAGEN方案中经常选择的缓冲液,因为它在pH7.0的条件下相比磷酸钠、Tris •Cl或醋酸钠而言具有更高的缓冲能力。SDS(十二烷基磺酸钠)与其他的阴离子去垢剂会竞争性结合于QIAGEN树脂的阴离子交换基团,从而对核酸结合造成干扰。如果在样品制备过程中使用了SDS,则必须在离心柱处理之前使用醋酸钾或酒精沉淀法对其进行去除。SDS的去除步骤已经整合进QIAGEN方案之中。

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Chemical structure of positively charged DEAE groups of QIAGEN Resin
Chemical structure of positively charged DEAE groups of QIAGEN resin.
Chemical structure of positively charged DEAE groups of QIAGEN resin, and negatively charged groups of the DNA backbone which interact with the resin.
Separation of nucleic acids at neutral pH on QIAGEN Anion-Exchange Resin
Separation of nucleic acids at neutral pH on QIAGEN anion-exchange resin.
Elution points of different nucleic acids from QIAGEN Resin as a function of pH and NaCl concentration
Elution points of different nucleic acids from QIAGEN Resin as a function of pH and NaCl concentration.