REPLI-g Mini Kit

For highly uniform whole genome amplification from small or precious samples
  • Easy amplification with consistent yields of up to 10 µg
  • Unbiased amplification of genomic loci
  • Reliable results due to Multiple Displacement Amplification (MDA)
  • Amplified DNA highly suitable for most downstream applications
  • No risk of DNA degradation during long-term storage

The REPLI-g Mini Kit provides optimized reagents for whole genome amplification (WGA) from small samples using innovative Multiple Displacement Amplification (MDA) technology. The typical DNA yield of a 50 μl reaction is  up to 10 μg, with an average product length greater than 10 kb (ranging between 2 kb and 100 kb). Unique REPLI-g technology delivers highly uniform WGA from a variety of small or precious sample types, including purified genomic DNA, or directly from fresh or dried blood, buccal swabs, fresh or frozen tissue, and cells. This simple and reliable method is capable of accurate and unbiased amplification of genomes and generates DNA that can be applied without further purification or quantification for downstream applications that do not require labeling. In contrast to PCR-based WGA technologies, high fidelity rates are increased up to 1000-fold, avoiding costly false positive or negative results.

製品名 Cat. no. List price:
REPLI g Human Control Kit 25
Human control DNA for 25 x 50 µl whole genome amplification reactions
150090
¥4,800
REPLI-g Mini Kit (25)
DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for 25 x 50 µl whole genome amplification reactions (typical yield 10 µg per reaction)
150023
¥30,000
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REPLI-g Mini Kit (100)
DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for 100 x 50 µl whole genome amplification reactions (typical yield 10 µg per reaction)
150025
¥92,000
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REPLI-g Mini Kit  は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


See trademarks.

どのようなタイプのサンプルでも一定したDNA収量|熱およびアルカリによる変性の遺伝子座への影響|長期安定性|精製gDNAあるいはREPLI-g増幅DNAで同等のNGS(次世代シークエンシング)結果|REPLI-g MiniおよびMidi 操作|正確なジェノタイピング|REPLI-g増幅の模式図|Phi29ポリメラーゼでバイアスのない増幅|均一かつ正確な増幅|均一かつ正確な全ゲノム増幅|様々な量のテンプレートから均一なDNA収量|信頼できるSNPジェノタイピング|
ゲノムDNA、ヘパリンおよびEDTA保存全血を含む様々なスタートサンプルをREPLI-g MidiおよびMini Kitで増幅した。40 µg (Midi Kit)および8~10 µg(Mini Kit)の典型的な収量が得られた。|加熱(95℃)あるいはスタンダードのREPLI-g Kitアルカリ溶解プロトコールによりゲノムDNAサンプル(10 ng)を変性した。REPLI-g DNA Polymeraseによる増幅後、2種類の遺伝子座のCT 値をサンプル間で比較した。REPLI-g Kitアルカリ溶解プロトコールを用いて増幅した遺伝子座のCT 値は低く、遺伝子座の増幅が正確に行なわれたことを示し、これらの遺伝子座で配列情報のロスがないことを意味する。|REPLI-gで増幅したDNAサンプルを4種類のフォーマットにて–20℃で表記した時間だけ保存し、リアルタイムPCRを行なった。2種類の遺伝子座、 [A] 遺伝子座Aおよび [B] 遺伝子座 B、に関してサンプルごとにアッセイを行なった。gDNA:REPLI-gで増幅していないゲノムDNA。保存のフォーマット:50 µlのREPLI-g反応液:1) 追加操作なし("50 µl REPLI-g"); 2) 5 µlを溶液から採取("5 µl REPLI-g"); 3) QIAamp Mini Kitで精製("50 µl QIAamp purified REPLI-g");および 4) 50 ng/µlに希釈(50 µl diluted REPLI-g")。|Bacillus subtilis ゲノムの全ゲノムシークエンシングを行なった。分析については、2 μgのゲノムDNAあるいはREPLI-g Midi Kitを使用して105 個の細胞から増幅したDNAを300 bpのフラグメントに切断した。ライブラリー調製のためにそれぞれ1 μgを使用した。 Illumina MiSeq装置を用いてシークエンシングを行なった。[A] gDNA およびREPLI-g増幅DNA両方で同等の塩基配列解析率が観察された。[B] ゲノム遺伝子座配列のアライメント比較では、gDNAに比べてREPLI-g増幅DNAでかなり高い比率の整合があることを示し、WGA(whole genome amplification)後でのジャンクDNAのレベルが最少であることを意味する。非増幅DNAおよびREPLI-g増幅DNAは同程度のエラー率(ミスマッチ、高品質エラー、indels、キメラ)が観察された。
(アライメントの比較はSMALT [Welcome Trust Sanger Institute]を用いて行なった)。|REPLI-g Mini Kitを用いたゲノムDNAの増幅は3つの基本的な操作ステップが必要である。テンプレートDNAの断片化および損傷を避けるため、まずサンプル(精製したゲノムDNA 10 ng、全血0.5 µl、組織培養細胞300個)のマイルドなアルカリ変性を行なう。次にサンプルを中和し、REPLI-g master mix を添加して30℃でインキュベートする。|REPLI-gテクノロジーを用いて20種類のDNAサンプルを増幅した後、DNA精製せずに3種類のSTR遺伝子座(CSF1PO、TPOX、THOI)を用いたジェノタイピング解析を行なった。結果を非増幅ゲノムDNAについて得られたものと比較した。DNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、銀染色により可視化した。2本のバンドをもつレーンは特定のSTR遺伝子座のヘテロ接合を表す一方、1本のバンドをもつレーンはホモ接合体を表している。|Phi 29 ポリメラーゼがDNAテンプレート上を移動し相補鎖を置換する。置換したDNA鎖が複製のテンプレートになり長鎖DNAが高い収量で複製される。|[A] DNAの二次構造によってはTaqポリメラーゼが合成を中止、テンプレートからスリップ、あるいは解離する。この結果、不正確なDNA増幅、不完全な遺伝子座の配列解析、短いサイズのフラグメントが生じる。[B] REPLI-g KitはPhi29ポリメラーゼを使用し、全ゲノムの正確で均一な増幅を実現する二次構造に置き換わる。|[A] REPLI-g テクノロジー、 [B] DOP-PCR、 [C] PEPにより増幅したDNAを用いて8つの遺伝子座の相対量をリアルタイム定量PCRにより測定した。増幅していない1 μgのコントロールDNAとの比較から遺伝子座の量を換算した(Dean, F.B. et al.(2002).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99, 5261.© 2002 National Academy of Sciences, USA.)。|REPLI-gテクノロジーで増幅した44個のサンプルを用いて、47種類のヒト遺伝子座(常染色体ごとに2遺伝子座、X染色体上の2遺伝子座、Y染色体上の1遺伝子座)に関してリアルタイムPCRを行なった。各サンプルは約10,000倍に増幅されたが、遺伝子座間の増幅の偏りは最大でもわずか6倍であった。|様々な量のヒトゲノムDNAを標準的なREPLI-g Midi Kit 反応で増幅し、記載時点で溶液の一部を採取した。 スタートサンプルの量とは無関係に、 50 µlの反応液から約40 µgの増幅DNAが得られた。|REPLI-gテクノロジーで増幅したDNAは精製操作を行なわず、ランダムに選んだ2つの遺伝子座(WIAF-1004およびWIAF-622)のSNPジェノタイピング(TaqMan 解析を使用)に用いた。各アレルが非常に収斂性よくクラスター化するので、ホモおよびヘテロ接合体のジェノタイピングの正確な結果を得ることができる。|
パフォーマンス
High yields from a variety of samples, suitable for numerous applications

With the REPLI-g Mini Kit, various clinical and non-clinical research samples can be used, including genomic DNA, fresh or dried blood, fresh or frozen tissue, and cells. Typical DNA yields per 50 µl reaction consistently reach 10 µg (see figure "Consistent DNA yields using any sample type"), while a uniform yield of amplified DNA is usually achieved regardless of the quantity of template DNA (see figure "Uniform DNA yield from various amounts of template"). Obtaining uniform DNA yields from varying template concentrations is always important, but particularly essential for high-throughput applications, which require subsequent genetic analyses to be possible without additional measurement or adjustment of DNA concentration.

The average product length of REPLI-g amplified DNA is typically more than 10 kb, with a range between 2 kb and 100 kb, enabling downstream applications such as complex restriction enzyme analysis and long-range PCR to be carried out. REPLI-g amplified DNA is highly suited for genotyping applications, such as SNP genotyping with TaqMan® primer/probe sets (see figure "Reliable SNP genotyping "), sequencing, and STR/microsatellite analysis (see figure "Accurate genotyping").

Successfully used in next-generation sequencing

Numerous publications have demonstrated the successful utilization of REPLI-g amplified DNA for next-generation sequencing (NGS) applications that range from exome and whole genome sequencing of tumor cells, to metagenomics research, to single cell analysis (for a range of recent publications that successfully used REPLI-g in NGS, please see our WGA resource page). Since the use of whole genome amplified DNA for NGS and array applications has been debated, we detected potential factors that could influence the success of using amplified DNA for these downstream applications. We determined that the quality of input material strongly influences the success of downstream NGS experiments. If working with low quality DNA (e.g., degraded DNA) or aged tissue material, the resulting amplified DNA may not give reliable results (data not shown). However, WGA, using REPLI-g technology, on intact cells or non-degraded purified DNA shows that NGS results are comparable to those obtained with purified gDNA. Sequence coverage and alignment comparison of the genomic loci sequence indicates minimized levels of junk DNA after WGA, whereas error rates are in a similar percentage range for both amplified and genomic DNA(see figure “Comparable NGS (next-generation sequencing) results obtained using purified gDNA or REPLI-g amplified DNA”).

High fidelity whole genome amplification

REPLI-g technology provides highly uniform DNA amplification across the entire genome. Phi29 polymerase can replicate up to 70 kb without dissociating from the genomic DNA template (see figure "Schematic representation of REPLI-g amplification"). In contrast to PCR-based whole genome amplification (WGA) technologies, Phi29 polymerase has 3'→5' exonuclease proofreading activity and maintains up to 1000-fold higher fidelity compared to Taq DNA polymerase during replication. Exonuclease-resistant primers provided in the kit ensure high yields of DNA product, and the WGA buffer system is optimized for very long read length and unbiased locus representation.

REPLI-g outperforms PCR-based WGA methods
 

Traditional methods of genomic DNA amplification include the time-consuming process of creating EBV-transformed cell lines followed by whole genome amplification using random or degenerate oligonucleotide-primed PCR. Also, PCR-based methods (e.g., DOP-PCR and PEP), as generally used by other suppliers, can produce nonspecific amplification artifacts and give incomplete coverage of loci. In several cases, DNA less than 1 kb long may be generated that cannot be used in many downstream applications. In general, the resulting DNA is generated with a much higher mutation rate due to the use of the low-fidelity enzyme Taq DNA polymerase, which can lead to error-prone amplification that results in, for example, single base-pair mutations, STR contractions, and expansions. In contrast to these disadvantages, REPLI-g provides highly uniform amplification across the entire genome, with minimal locus bias and minimized mutation rates during amplification (see figures "Highly representative amplification using REPLI-g technology" and "Consistent and accurate whole genome amplification").

原理

Unique REPLI-g technology uses the innovative, high-fidelity enzyme Phi 29 polymerase to amplify complex genomic DNA using Multiple Displacement Amplification (MDA) combined with a gentle alkaline denaturation step to amplify genomic loci uniformly. The typical yield of the REPLI-g Mini Kit is up to 10 µg, and can be easily scaled down according to your needs with the REPLI-g Midi Kit, since both kits are based on the same protocol and use the same reaction volumes. The easy reaction set-up and very low handling time of approximately 15 minutes makes REPLI-g an easy and reliable method to use when complete and unbiased locus representation is needed from limited or precious samples.

Amplification principle

REPLI-g uses isothermal genome amplification, termed Multiple Displacement Amplification (MDA), which involves the binding of random hexamers to denatured DNA followed by strand displacement synthesis at a constant temperature with the enzyme Phi29 polymerase. Additional priming events occur on each displaced strand that serve as a template, enabling generation of high yields of amplified DNA (see figure “Schematic representation of REPLI-g amplification”). Phi 29 polymerase, a phage derived enzyme, is a DNA polymerase with 3'→5' prime exonuclease activity (proofreading activity) that delivers up to 1000-fold higher fidelity compared to Taq DNA polymerase. Supported by the unique, optimized REPLI-g buffer system, Phi 29 polymerase easily solves secondary structures such as hairpin loops, thereby preventing slipping, stoppage, and dissociation of the polymerase during amplification. This enables the generation of DNA fragments up to 100 kb without sequence bias (see figure "Unbiased amplification with Phi 29 polymerase").

Alkaline denaturation of DNA

Genomic DNA must be denatured before use in enzymatic amplification procedures, which is often accomplished using harsh methods such as incubation at elevated temperatures (heat incubation) or increased pH (chemical alkaline incubation). The REPLI-g Midi Kit uses gentle alkaline incubation, allowing uniform DNA denaturation with very low DNA fragmentation or generation of abasic sites. This results in amplified DNA with very high integrity, and maximizes the length of amplified fragments so that genomic loci and sequences are uniformly represented. With the REPLI-g Mini Kit, reliable results without false positive or negative data are ensured in subsequent downstream applications, unlike with other WGA technologies that use heat-induced denaturation that can damage template DNA, leading to biased and underrepresented loci (see figure "Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation").

操作手順
Simple, one tube procedure

The REPLI-g Mini Kit uses a simple and reliable method to achieve accurate genome amplification from small quantities of isolated target genomic DNA, or directly from whole blood, dried blood cards, buffy coat, and tissue culture cells (see figure "REPLI-g Mini and Midi procedure"). The addition of lysis buffer, which both lysis the sample material and denatures the DNA, is followed by a short minute incubation (see figure "REPLI-g Mini and Midi procedure"). After neutralization, master mix (including REPLI-g Mini DNA Polymerase) is added and the isothermal amplification reaction proceeds overnight at 30°C. REPLI-g amplified DNA can be stored long-term at –20°C with no negative effects (see figure "Consistent long-term stability").

Select the REPLI-g Kit most suited to your specific requirements from our complete range of dedicated REPLI-g products (see table).

Specifications for the wide range of REPLI-g Kits
REPLI-g Single Cell REPLI-g Mini REPLI-g UltraFast Mini REPLI-g Midi REPLI-g Screening REPLI-g FFPE REPLI-g Mitochondrial DNA
Starting material Single cells, gDNA Purifed gDNA, blood, cells Purifed gDNA, blood, cells FFPE tissue, purified gDNA from FFPE tissue Purified gDNA
(Protocols for other starting materials available from www qiagen.com)
Input amount Single cells, 2–1000 cells, tissue, purified gDNA (1–10 ng) >10 ng gDNA, 0.5 µl blood or cells (>600 cells/µl) >10 ng gDNA, 0.5 µl blood or cells (>600 cells/µl) Section (1 cm diamter, 10–40 µm thick); >100 ng gDNA >1 ng purified gDNA
Yield (µg/reaction) 40 10 7–10 40 8 Standard yield: ≤10; High yield: ≤40 3–5
Reaction time 8–16 h 10–16 h 1.5 h 8–16 h 12–16 h Standard yield: 4 h; High yield: 10 h 8 h
Hands-on time 15 min 15 min 15 min 15 min 15 min 40 min 15 min
Format Tube Tube Tube Tube Plate Tube Tube
アプリケーション

REPLI-g amplified genomic can be used in a variety of downstream applications, including:

  • SNP genotyping with TaqMan® primer/probe sets
  • qPCR- and PCR-based mutation detection
  • Next-generation sequencing
  • STR/microsatellite analysis
  • Sanger sequencing
  • RFLP and Southern blot analysis
  • Array technologies, such as comparative genomic hybridization 
Feature
Specifications
Amplification Whole genomic DNA
Applications Genotyping, hybridization, RFLP
Denaturation step Alkaline
Maximum input volume >10 ng DNA, 0.1– 0.5 µl whole blood, >600 cells/µl
Minimal pipetting volume needed 0.5 µl
Quality assessment No
Reaction time 8–16 hours (overnight)
Reaction volume 50 µl
Samples per run (throughput) Mid
Starting amount of DNA >10 ng purified genomic DNA
Starting material Genomic DNA, blood, cells, tissue
Technology Multiple Displacement Amplification (MDA)
Yield 10–40 µg

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パンフレット
1
Second edition — innovative tools
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FAQ
40
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FAQ ID -686
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FAQ ID -712
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FAQ ID -713
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MSDS
1
Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.
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クイックスタートプロトコール
1
キットハンドブック
1
For whole genome amplification from purified genomic DNA, blood, and cells
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画像
Consistent DNA Yields Using any Sample Type.
どのようなタイプのサンプルでも一定したDNA収量

ゲノムDNA、ヘパリンおよびEDTA保存全血を含む様々なスタートサンプルをREPLI-g MidiおよびMini Kitで増幅した。40 µg (Midi Kit)および8~10 µg(Mini Kit)の典型的な収量が得られた。

Effect of Heat and Alkaline Denaturation on Loci Representation.
熱およびアルカリによる変性の遺伝子座への影響
加熱(95℃)あるいはスタンダードのREPLI-g Kitアルカリ溶解プロトコールによりゲノムDNAサンプル(10 ng)を変性した。REPLI-g DNA Polymeraseによる増幅後、2種類の遺伝子座のCT 値をサンプル間で比較した。REPLI-g Kitアルカリ溶解プロトコールを用いて増幅した遺伝子座のCT 値は低く、遺伝子座の増幅が正確に行なわれたことを示し、これらの遺伝子座で配列情報のロスがないことを意味する。
Consistent long-term stability
長期安定性
REPLI-gで増幅したDNAサンプルを4種類のフォーマットにて–20℃で表記した時間だけ保存し、リアルタイムPCRを行なった。2種類の遺伝子座、 [A] 遺伝子座Aおよび [B] 遺伝子座 B、に関してサンプルごとにアッセイを行なった。gDNA:REPLI-gで増幅していないゲノムDNA。保存のフォーマット:50 µlのREPLI-g反応液:1) 追加操作なし("50 µl REPLI-g"); 2) 5 µlを溶液から採取("5 µl REPLI-g"); 3) QIAamp Mini Kitで精製("50 µl QIAamp purified REPLI-g");および 4) 50 ng/µlに希釈(50 µl diluted REPLI-g")。
Comparable NGS results obtained using gDNA or REPLI-g amplified DNA
精製gDNAあるいはREPLI-g増幅DNAで同等のNGS(次世代シークエンシング)結果
Bacillus subtilis ゲノムの全ゲノムシークエンシングを行なった。分析については、2 μgのゲノムDNAあるいはREPLI-g Midi Kitを使用して105 個の細胞から増幅したDNAを300 bpのフラグメントに切断した。ライブラリー調製のためにそれぞれ1 μgを使用した。 Illumina MiSeq装置を用いてシークエンシングを行なった。[A] gDNA およびREPLI-g増幅DNA両方で同等の塩基配列解析率が観察された。[B] ゲノム遺伝子座配列のアライメント比較では、gDNAに比べてREPLI-g増幅DNAでかなり高い比率の整合があることを示し、WGA(whole genome amplification)後でのジャンクDNAのレベルが最少であることを意味する。非増幅DNAおよびREPLI-g増幅DNAは同程度のエラー率(ミスマッチ、高品質エラー、indels、キメラ)が観察された。
(アライメントの比較はSMALT [Welcome Trust Sanger Institute]を用いて行なった)。
REPLI-g Mini and Midi procedure
REPLI-g MiniおよびMidi 操作

REPLI-g Mini Kitを用いたゲノムDNAの増幅は3つの基本的な操作ステップが必要である。テンプレートDNAの断片化および損傷を避けるため、まずサンプル(精製したゲノムDNA 10 ng、全血0.5 µl、組織培養細胞300個)のマイルドなアルカリ変性を行なう。次にサンプルを中和し、REPLI-g master mix を添加して30℃でインキュベートする。

Accurate Genotyping.
正確なジェノタイピング

REPLI-gテクノロジーを用いて20種類のDNAサンプルを増幅した後、DNA精製せずに3種類のSTR遺伝子座(CSF1PO、TPOX、THOI)を用いたジェノタイピング解析を行なった。結果を非増幅ゲノムDNAについて得られたものと比較した。DNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、銀染色により可視化した。2本のバンドをもつレーンは特定のSTR遺伝子座のヘテロ接合を表す一方、1本のバンドをもつレーンはホモ接合体を表している。

Schematic representation of REPLI-g amplification
REPLI-g増幅の模式図

Phi 29 ポリメラーゼがDNAテンプレート上を移動し相補鎖を置換する。置換したDNA鎖が複製のテンプレートになり長鎖DNAが高い収量で複製される。

Unbiased amplification with Phi29 polymerase
Phi29ポリメラーゼでバイアスのない増幅
[A] DNAの二次構造によってはTaqポリメラーゼが合成を中止、テンプレートからスリップ、あるいは解離する。この結果、不正確なDNA増幅、不完全な遺伝子座の配列解析、短いサイズのフラグメントが生じる。[B] REPLI-g KitはPhi29ポリメラーゼを使用し、全ゲノムの正確で均一な増幅を実現する二次構造に置き換わる。
Highly representative amplification using REPLI-g technology
均一かつ正確な増幅
[A] REPLI-g テクノロジー、 [B] DOP-PCR、 [C] PEPにより増幅したDNAを用いて8つの遺伝子座の相対量をリアルタイム定量PCRにより測定した。増幅していない1 μgのコントロールDNAとの比較から遺伝子座の量を換算した(Dean, F.B. et al.(2002).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99, 5261.© 2002 National Academy of Sciences, USA.)。
Consistent and accurate whole genome amplification
均一かつ正確な全ゲノム増幅

REPLI-gテクノロジーで増幅した44個のサンプルを用いて、47種類のヒト遺伝子座(常染色体ごとに2遺伝子座、X染色体上の2遺伝子座、Y染色体上の1遺伝子座)に関してリアルタイムPCRを行なった。各サンプルは約10,000倍に増幅されたが、遺伝子座間の増幅の偏りは最大でもわずか6倍であった。

Uniform DNA Yield from Various Amounts of Template.
様々な量のテンプレートから均一なDNA収量
様々な量のヒトゲノムDNAを標準的なREPLI-g Midi Kit 反応で増幅し、記載時点で溶液の一部を採取した。 スタートサンプルの量とは無関係に、 50 µlの反応液から約40 µgの増幅DNAが得られた。
Reliable SNP genotyping
信頼できるSNPジェノタイピング

REPLI-gテクノロジーで増幅したDNAは精製操作を行なわず、ランダムに選んだ2つの遺伝子座(WIAF-1004およびWIAF-622)のSNPジェノタイピング(TaqMan 解析を使用)に用いた。各アレルが非常に収斂性よくクラスター化するので、ホモおよびヘテロ接合体のジェノタイピングの正確な結果を得ることができる。