메타지놈 염기서열 분석

미생물 군집 이해

마이크로바이옴 연구는 박테리아, 진균, 고세균, 바이러스가 우리의 삶과 환경에 미치는 영향을 이해하는 데 도움을 줍니다. 과거 마이크로바이옴 연구는 미생물 배양 역량에 의해 제한되었습니다. 

그러나 모든 미생물이 실험실 배양이 가능한 것은 아니며, 인공적인 순수 배양에서는 미생물의 특성, 행동 및 진화 경로를 좌우하는 다른 종과의 상호작용이 차단됩니다. 이것은 petri dish에 있는 미생물의 유전자형과 표현형이 자연에서 발견되는 것과 매우 다를 가능성이 있음을 의미합니다⁽¹⁾. 

미생물 차세대 염기서열 분석(NGS) 방법을 통해 우리 몸 안팎 및 주변에 존재하는 미생물에 대한 중요한 유전적 인사이트를 얻을 수 있습니다.

메타지노믹스 또는 메타지놈 염기서열 분석이란 무엇인가요?

군집 유전체학으로도 알려진 메타지노믹스는 개별 종을 분리, 배양하지 않고 자연 환경에서 미생물 군집을 유전적으로 분석하는 방법입니다. 이 방법은 군집 내 생화학적, 대사적 상호작용에 대한 포괄적인 인사이트를 제공합니다.  

메타지노믹스는 사전 분리 없이 미생물 서식지 내 개별 종을 식별하는 데에도 도움이 됩니다. 또한 환경 스트레스 조건에서 미생물의 적응 메커니즘뿐만 아니라, 군집 내부에서의 상호작용과 주변 환경의 다른 구성 요소들과의 상호작용도 밝혀낼 수 있습니다.

마이크로바이옴 연구에서의 메타지노믹스

현재 널리 사용되는 메타지놈 염기서열 분석 기법은 세 가지가 있습니다. 전체 유전체 샷건 염기서열 분석은 박테리아와 함께 박테리아가 아닌 미생물(예: 곰팡이 및 바이러스)을 동시에 연구할 수 있지만⁽²⁾, 더 많은 염기서열 분석 예산을 필요로 합니다. 또한 16S/18S/ITS 염기서열 분석은 특정 표적 영역에만 집중할 수 있습니다. 이는 박테리아 계통 및 분류 연구에 유용합니다⁽³⁾. 메타전사체학은 군집의 유전자 발현을 조사하는 방법으로, WGS 샷건 또는 16S/18S/ITS 염기서열 분석이 제공하는 군집 구성과 잠재 기능에 대한 정적 스냅샷을 보완하며, 대사 활동이나 숙주-마이크로바이옴 상호작용과 같은 동적 인사이트를 제공합니다.

또한 메타지놈 염기서열 분석 방식은 새로운 생물(예: 팬데믹 초기의 SARS-CoV-2)의 de novo gemone assembly, 알려진 생물체의 완전한 유전체 확보, 또는 고처리량 염기서열 분석의 강점을 활용한 수백 종 간 유전체 비교를 지원합니다.

현재 방법의 한계점

WGS, 16S/18S/ITS, 메타전사체학과 같은 메타지놈 염기서열 분석 기법은 미생물 군집 연구를 위한 강력한 도구지만, 몇 가지 한계를 가지고 있습니다. 

전체 유전체 샷건 염기서열 분석은 비균일한 유전체 커버리지와 같은 bias가 발생할 수 있으며, 이는 미생물 풍부도 추정의 정확성에 영향을 미칩니다⁽⁴⁾.

16S/18S/ITS 염기서열 분석의 증폭 단계에서는 리보솜 유전자 copy number 차이와 PCR artifact로 인해 bias가 발생할 수 있습니다. 이는 미생물 풍부도 표현을 왜곡할 수 있습니다⁽⁵⁾. 또한 16S/18S/ITS 염기서열 분석에 사용되는 universal 프라이머는 모든 표적 서열에 동일하게 결합하지 않을 수 있어, 일부 분류군의 검출이 불완전하거나 bias가 발생할 수 있습니다⁽⁶⁾.

메타전사체학은 보람이 있지만 매우 복잡합니다. 복잡한 미생물 군집 샘플로 RNA-seq을 수행할 때 민감도 문제가 발생할 수 있습니다. 이 경우, On-target read가 부족하고 저발현 mRNA 전사체를 포착하지 못하게 됩니다. 즉, RNA-seq 최적화를 위해 수 시간의 작업이 필요함을 의미합니다. 이 글은 메타전사체학 분석에서 RNA-seq read를 낭비하지 않는 방법을 요약합니다. 

참고 문헌:

1. National Research Council (US) Committee on Metagenomics: Challenges and Functional Applications. The New Science of Metagenomics: Revealing the Secrets of Our Microbial Planet. Washington (DC): National Academies Press (US); 2007.
2. Jovel, J. et al. (2016) Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Front Microbiol. 7, 459.
3. Janda, J. M. and Abbott, S. L. (2007) 16s rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Clin. Microbiol. 45(9), 2761–2764.
4. Chouvarine, P., Wiehlmann, L., Losada, P., DeLuca, D., & Tümmler, B. (2016). Filtration and Normalization of Sequencing Read Data in Whole-Metagenome Shotgun Samples. PLoS ONE, 11.
5. Khachatryan, L., Leeuw, R., Kraakman, M., Pappas, N., Raa, M., Mei, H., Knijff, P., & Laros, J. (2020). Taxonomic classification and abundance estimation using 16S and WGS-A comparison using controlled reference samples. Forensic science international. Genetics, 46, 102257.
6. Losada, P., Tümmler, B., Wiehlmann, L., & Chouvarine, P. (2014). Whole metagenome shotgun sequencing analysis of microbiome of cystic fibrosis- and COPD patients. European Respiratory Journal, 44, 1212.